[發明專利]一種基于PCR的低成本、簡單、高效的SNP檢測方法

無效

• 申請號: 201010139370.5
• 申請日: 2010-03-12
• 公開（公告）號: CN102191314A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 孫朝輝
• 申請（專利權）人: 孫朝輝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G06F19/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于PCR的用于檢測SNP的方法，其特征在于，a)每個SNP的每個等位基因都有一個特異的引物和相對應的長度唯一的PCR產物；b)針對檢測中采用的DNA檢測手段的特性，尋找一種優化的PCR產物長度分配方案，以增大檢測SNP的數目；c)根據設計的PCR產物長度分配方案及待測SNP，按一定算法，逐個地設計和優化所有SNP的PCR引物。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，每個SNP有兩對特異引物，引物1(中心引物)的3’端與DNA的A鏈的SNP的一個等位基因x配對，引物2(側端引物)與A鏈下游的序列配對；引物3(中心引物)的3’端與DNA的B鏈的SNP的另一個等位基因y配對，引物4(側端引物)與B鏈下游的序列配對；引物1和2可以從帶有等位基因x的DNA擴增出長度為a的片段，引物3和4可以從帶有等位基因y的DNA擴增出長度為b的片段，a不等于b。

3.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，利用一種算法找到可以檢測盡量多SNP的PCR產物長度分配方案，其步驟如下：

根據可檢測的DNA長度范圍(O，L)和分辨率(S)，算出可以檢測的DNA的不同長度的數目為N＝L/S；

將這算法的目的抽象為：對一個數列(1，2，…，N-1，N)，每個SNP從此數列中抽取三個不同的數a、b、c，使a+b＝c，要找到一個抽取數字的方式，使得盡可能多的SNP能抽到數；

循環進行以下兩個取數步驟，直到取不到合適的數為止：1)從以上數列的兩端取出3個還未被取走的數a、b、c，使a+b＝c，賦給下一個SNP，2)從數列的中間點兩側取出3個還未被取走數a、b、c，使a+b＝c，賦給再下一個SNP；

根據每個SNP取到的3個數a、b、c和分辨率(S)，可得出該SNP的3個產物長度，即a×S、b×S、c×S。

4.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，在逐個為每個SNP設計引物時，將新設計的引物序列與已經設計好的引物序列進行一一比較，看看引物之間是否會形成交叉二聚體；如果該SNP的側端引物與別的引物形成二聚體，則將該SNP的側端引物的位置做變動，來消除這些二聚體；如果是該SNP的中心引物與另一個SNP的側端引物形成二聚體，則將另外那個SNP移至待設計的SNP列表的最后，以待重新設計引物。

5.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，在逐個為每個SNP設計引物時，每次將新設計的引物序列與前面已經設計的引物序列一一配對，再使用窮盡的序列比較方法(可以是，但不限于TAGSCAN)與基因組進行比較，看是否有長度小于最大檢測長度的非特異性擴增；如果該SNP的側端引物與別的引物配對導致非特異性擴增，則將該SNP的側端引物的位置做變動，來消除這些非特異性擴增；如果是該SNP的中心引物與另一個引物SNP的側端引物配對產生非特異擴增，則將另外那個SNP移至待設計的SNP列表的最后，以待重新設計引物；如果該SNP的中心引物與別的SNP的中心引物配對產生非特異性擴增，則可將該SNP中心引物的長度做調整，以試圖消除非特異性擴增；如果無法通過調整引物來消除非特異性擴增，則可增加引物長度和退火溫度，重新設計所有引物。

6.由以上方法得出的PCR引物和實驗方案，其特征是，每個SNP的每個等位基因對應一個唯一的PCR產物長度，PCR產物長度分配充分利用了檢測的空間，引物和實驗設計排除了非特異性擴增；利用所設計引物和實驗方案進行單個PCR反應，再用實驗方案中指明的手段檢測產物長度，就可確定所有SNP的基因型。