[發(fā)明專利]用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脫氫酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010138550.1
• 申請日: 2010-04-02
• 公開（公告）號(hào): CN101942465A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高秀峰;趙緒光;王國慶;李永生
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02;C12N1/21;C12R1/19
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

酒精對(duì)人體有害，尤其對(duì)肝臟最為嚴(yán)重，同時(shí)對(duì)胃腸道、胰腺、心臟、腎臟等也會(huì)造成不同程度的損害。世界衛(wèi)生組織在一份報(bào)告中提出：“酒精中毒是當(dāng)今世界第一公害，其毒性可累及全身主要器官，對(duì)肝臟的影響最大。在西方國家，80％的肝硬變(liver?cirrhosis)與酒精中毒有關(guān)。酒精中毒對(duì)病毒性肝炎、肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都有重要影響。?

酒精在人體內(nèi)的代謝主要靠體內(nèi)的兩種酶：一種是乙醇脫氫酶(Alcohol?Dehydrogenase，ADH)；另一種是乙醛脫氫酶(Aldehyde?Dehydrogenase，ALDH)。前者使乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，而后者則使乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸，乙酸可通過轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(CoA)而進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終分解為二氧化碳和水。一般來說，人體中都存在前一種酶，而且數(shù)量基本是相等的，但缺少后一種酶的人就比較多。ALDH的缺少，使乙醇不能被完全分解為二氧化碳和水，而以乙醛的形式繼續(xù)留在體內(nèi)。目前，大量國內(nèi)外的研究表明，乙醛在體內(nèi)過度積累是肝損害的主要原因。因此利用上述乙醛脫氫酶的特性和功效開發(fā)有效的解酒藥具有較高的應(yīng)用價(jià)值和市場前景。乙醛脫氫酶可從一些動(dòng)物的肝臟、胰腺等內(nèi)臟進(jìn)行提取，但提取過程較為復(fù)雜，成本高，不易規(guī)模化生產(chǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：開發(fā)一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶的方法，發(fā)明內(nèi)容如下：?

A.克隆嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段；?

B.嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段分別與pET30b(+)表達(dá)載體重組，構(gòu)成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重組載體；?

C.pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)卡那霉素篩選，獲得表達(dá)乙醛脫氫酶的BL21(DE3)工程菌；?

D.表達(dá)乙醛脫氫酶的BL21(DE3)工程菌在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)種子及發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，從發(fā)酵液提取、分離得到乙醛脫氫酶粗酶液。?

本發(fā)明的各種特征如下：?

1.利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶的方法，其特征在于克隆嗜堿耐鹽芽孢桿菌乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段為：克隆的嗜堿耐鹽芽孢桿菌乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段長度分別是1521bp和1359bp。?

2.利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶的方法，其特征在于嗜堿耐鹽芽孢桿菌乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段分別與pET30b(+)表達(dá)載體重組，構(gòu)成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重組載體方法為：?

A.嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)，其乙醛脫氫酶基因aldA原始克隆的大小為1521bp，用?Nde?I和HindIII酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：?

混勻后37℃酶切4h，于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收目的片段。?

嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)，其乙醛脫氫酶基因aldB原始克隆的大小為1359bp，用NdeI和BamH?I酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：?

B.表達(dá)載體pET30b(+)的雙酶切?

乙醛脫氫酶基因aldA使用的表達(dá)載體pET30b(+)大小為5.5kb，用Nde?I和HindIII對(duì)pET30b(+)進(jìn)行雙酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：?

乙醛脫氫酶基因aldB使用的表達(dá)載體pET30b(+)大小為5.5kb，用Nde?I和BamH?I對(duì)pET30b(+)進(jìn)行雙酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：?

混勻后37℃酶切4h，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收pET30b(+)大片段。?