[發(fā)明專利]用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脫氫酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010138550.1
• 申請日: 2010-04-02
• 公開（公告）號: CN101942465A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高秀峰;趙緒光;王國慶;李永生
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02;C12N1/21;C12R1/19
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1.一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶的方法，其特征包括如下步驟：

A.克隆嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段；

B.嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段分別與pET30b(+)表達(dá)載體重組，構(gòu)成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重組載體；

C.pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)卡那霉素篩選，獲得表達(dá)乙醛脫氫酶的BL21(DE3)工程菌；

D.表達(dá)乙醛脫氫酶的BL21(DE3)工程菌在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)種子及發(fā)酵擴大培養(yǎng)，從發(fā)酵液提取、分離得到乙醛脫氫酶粗酶液。

2.按權(quán)利要求1所述的一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶的方法，其特征在于克隆嗜堿耐鹽芽孢桿菌乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段為：克隆的嗜堿耐鹽芽孢桿菌乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段長度分別是1521bp和1359bp。

3.按權(quán)利要求1所述的一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)乙醛脫氫酶的方法，其特征在于嗜堿耐鹽芽孢桿菌乙醛脫氫酶aldA和aldB基因片段分別與pET30b(+)表達(dá)載體重組，構(gòu)成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重組載體為：

A.嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)，其乙醛脫氫酶基因aldA原始克隆的大小為1521bp，用Nde?I和HindIII酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：

混勻后37℃酶切4h，于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收目的片段。

嗜堿耐鹽芽孢桿菌(Bacillus?halodurans?XJU-1)，其乙醛脫氫酶基因aldB原始克隆的大小為1359bp，用NdeI和BamH?I酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：

B.表達(dá)載體pET30b(+)的雙酶切

乙醛脫氫酶基因aldA使用的表達(dá)載體pET30b(+)大小為5.5kb，用Nde?I和HindIII對pET30b(+)進(jìn)行雙酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：

乙醛脫氫酶基因aldB使用的表達(dá)載體pET30b(+)大小為5.5kb，用Nde?I和BamH?I對pET30b(+)進(jìn)行雙酶切，其酶切反應(yīng)體系如下：

混勻后37℃酶切4h，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收pET30b(+)大片段；

C.pET30b(+)大片段分別與乙醛脫氫酶基因aldA和aldB酶切產(chǎn)物的連接

分別將乙醛脫氫酶基因aldA和aldB酶切產(chǎn)物與pET30b(+)大片段以1∶3的摩爾比混合，進(jìn)行連接反應(yīng)，其連接反應(yīng)體系如下：

混勻后4℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于含有50μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16-20小時。