[發明專利]一種添加二甲基亞砜提高紅霉素發酵的方法

有效

• 申請號: 201010138213.2
• 申請日: 2010-04-02
• 公開（公告）號: CN102041288A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 高淑紅;陳長華;丁盼盼;朱義彬;呂和平;武培;馬朝安
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;河南天方藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C12R1/01
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所 31230
• 代理人: 朱小晶

【技術領域】

本發明涉及生物技術領域，具體地說，是一種添加二甲基亞砜提高紅霉素發酵的方法。

【背景技術】

紅霉素(erythromycin，Er)是一類大環內酯類抗生素，包括紅霉素A(ErA)、紅霉素B(ErB)、紅霉素C(ErC)、紅霉素D(ErD)、紅霉素E(ErE)和紅霉素F(ErF)。在臨床上具有廣泛用途的是紅霉素A，它的抑菌活性最高，最初從一種放線菌--紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora?erythraea)中分離出來。中國藥典95版規定紅霉素成品的生物效價按無水物計算每1mg效價不得少于920紅霉素單位以控制其質量。

紅霉素生物合成的一般途徑如Fig.1。以丙酰CoA和甲基丙二酰CoA為起始原料，在聚酮合成酶(polyketide?synthase，PKS)的催化下，經縮合、酮還原、脫水和烯還原等多輪循環生成紅霉素母核6-脫氧-紅霉內酯B(6-deoxycrythronolide?B，6-dEB)，然后經母核大環C-6羥基化、C-3和C-5O-糖基化、C-3-O-糖基上C-3″-O-甲基化及C-12羥基化，完成紅霉素母核的后修飾，形成紅霉素A。紅霉素A合成途徑中有兩步羥基化反應，即C-6位和C-12位，分別由羥化酶EryF和EryK催化，這兩個酶的空間結構類似于一種細胞色素P450。對于羥基化反應，有文獻報道小分子有機溶劑(如二甲基亞砜DMSO、丙酮、乙醇等)可使細胞色素P450酶mRNA量增加，實驗證實，添加小分子有機溶劑二甲基亞砜和丙酮能提高細胞色素P450酶的表達量，促進紅霉素合成。

【發明內容】

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種添加二甲基亞砜提高紅霉素發酵的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種添加二甲基亞砜提高紅霉素發酵的方法，具體步驟為：

(1)菌種

紅色糖多孢菌HD(Saccharopolyspora?erythraea，HD)，本實驗室保藏菌種，

參見申請人申請的中國發明專利CN101519637A；

淀粉、黃豆餅粉、糊精由河南天方藥業集團提供，其余原料均為工業純市售產品；

(2)培養基

搖瓶種子及罐一級種子培養基(％)可溶性淀粉2.0，糊精2.5，黃豆餅粉2.5，玉米漿0.8，硫酸銨0.18，氯化鈉0.4，碳酸鈣0.2，豆油0.2；裝量30ml/250ml，消前pH?7.4；

搖瓶發酵培養基(％)：淀粉5.0，黃豆餅粉3.0，玉米漿0.4，硫酸銨0.15，碳酸鈣0.4，豆油0.2，葡萄糖2.5，pH?7.0～7.2；

罐二級種子培養基(％)淀粉2.0，黃豆餅粉2.5，糊精2.5，玉米漿2.3，硫酸銨0.15，碳酸鈣0.20，豆油0.2，消前pH?7.4；

罐發酵培養基(％)淀粉5.0，黃豆餅粉2.5，糊精2.5，玉米漿2.3，硫酸銨0.15，碳酸鈣0.20，豆油0.2，消前pH?7.0～7.2；

(3)搖瓶培養方法

種子培養：將種子液在34℃的搖床間培養48h，搖床轉速為220～240r/min；

搖瓶發酵培養：將接入種子液的發酵液在34℃的搖床間培養，搖床轉速為220～240r/min，加入二甲基亞砜，濃度為0.08～0.56％，添加時間為0～120h；

所述的二甲基亞砜濃度優選為0.16％；

所述的培養時間優選為48h；

(4)罐發酵培養

將甘油管保藏的菌株按10％接種量接入裝有60ml一級種子培養基的500ml一級種子瓶，(34+1)℃培養48h后，按相同接種量接入裝量相同的500ml二級種子瓶中，同溫培養24h，再按10％接種量接入裝有10L發酵培養基的15L發酵罐中，培養7d；

本發明的二甲基亞砜也可以由丙酮，乙醇來代替，或者其他能提高P450酶的試劑等。

與現有技術相比，本發明的積極效果是：

由于二甲基亞砜是具有一定毒性的物質，濃度過高加入，效價顯著下降，因此在合適的時間添加適量的二甲基亞砜才會在基本不影響菌體正常代謝的條件下提高的發酵效價。

48h向培養基中流加0.16％的二甲基亞砜，紅霉素的效價達7916u/ml，比對照提高11.3％。進一步研究發現，二甲基亞砜可以提高羥基化酶P450單加氧酶的含量，從而提高紅霉素產量。

【附圖說明】

圖1不同時間添加二甲基亞砜對紅霉素效價的影響圖；