[發明專利]一種殺菌/通透性增強蛋白-人酸性成纖維細胞生長因子融合蛋白及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201010136512.2
• 申請日: 2010-03-26
• 公開（公告）號: CN101838330A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 朱家勇;馬艷;金小寶;李小波;梅寒芳;吳強;褚夫江;盧雪梅;王艷
• 申請（專利權）人: 廣東藥學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;A61K38/18;A61P31/00;A61P17/02;A61K38/16
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及基因工程抗菌蛋白的制備領域，具體涉及一種殺菌/通透性增強蛋白-人酸性成纖維細胞生長因子融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

隨著現代文明與高科技不斷發展，許多傳染病、營養不良性疾病得到有效控制，乃至基本消失，但創傷卻有增無減。全球每年創傷人數達數千萬、致死者約200余萬人，在我國每年創傷數百萬人、致死人數至少有20余萬。傷口在愈合過程中，損傷創面壞死的細胞常成為細菌的最好培養基，很容易受到細菌等感染，G菌感染引發的內毒素釋放及腸源性內毒素易位，引起菌血癥或膿毒血癥；內毒素侵入體內后，首先與血漿中的內毒素結合蛋白(LBP)結合，再與單核細胞、巨噬細胞等髓源性細胞表面的脂多糖受體CD14(mCD14)或血漿中的可溶性受體CD14(sCD14)結合，激活單核-巨噬細胞系統，引起體內炎癥介質的大量合成、釋放、啟動全身炎癥反應，最終誘發肝腎衰竭，心血管或血液系統衰竭等多臟器功能障礙綜合癥(MODS)。從創傷病例分析，傷后修復7～14天感染、中毒、繼發多臟器功能障礙綜合癥(MODS)是死亡主要原因之一。許多學者對MODS的感染機制研究表明：感染時內毒素(LPS)在MODS發生中起著“扳機”作用。LPS是G外膜的主要組成部分，同時也是G致病的重要因素。如何在促進傷口愈合的同時避免細菌感染、預防多臟器功能障礙綜合癥(MODS)的發生是一個極為重要的課題。

殺菌/通透性增強蛋白(bacteriacidal/permeability-increasing?protein，BPI)為一種小分子蛋白，與LBP具有較高同源性，與LPS的親和力遠大于LBP，BPI-LPS復合物既可防止巨噬細胞的激活，中和內毒素的毒力，阻斷內毒素的多種作用。另外BPI與G細菌外膜也可特異性結合，使細菌停止生長而最終導致細菌溶解死亡。

BPI最早是Wesis等(1978年)從人中性粒細胞中分離獲得的抗菌蛋白，相對分子質量55×10³，主要存在于人和哺乳動物的多形核粒細胞(PMN)的嗜天青顆粒中，為PMN的主要抗菌成分，占其細胞總蛋白的0.5％～1.0％，在粒細胞分化的早幼粒階段合成并儲存于胞漿顆粒中，也微量存在于細胞表面及淚腺中。Takahashi和Levy等在人及小鼠的皮膚和黏膜上皮細胞發現BPI的存在，同時證明BPI在發囊和黏膜上皮抗感染的過程中起著重要作用。

天然BPI是一種由456個氨基酸殘基組成，呈特殊的“回飛棒”形。晶體結構顯示一個對稱的、一分為二的蛋白質構象。由各200個氨基酸左右的N-末端區和C-末端區及富含脯氨酸的21個氨基酸殘基(230～250)中間連接單位三部分組成，經蛋白酶水解后可裂解為25KD的N端片斷和30KD的C端片斷，其中N端功能片段(1～199)是含很高比例的堿基和親水殘基的堿性蛋白，具有完整BPI殺菌、結合/中和LPS的全部活性。體內外實驗表明BPI及其功能性N端片段對LPS具有拮抗作用，阻斷或降低感染時由LPS引起的病理損傷。同時BPI是正常存在于人和哺乳動物多形核中性粒細胞(polymorphonuclear?neutrophil，PMN)嗜天青顆粒中和微量表達于PMN表面的自身成分，機體可對其形成天然的免疫耐受。BPI及其功能性N端片段由于其獨特地抗菌機制及結合/中和內毒素功能，使其在創傷的臨床治療中具有良好的應用價值。

目前美國Xoma公司開發的CHO細胞表達重組BPI氨基端蛋白處于世界領先水平，該分子單獨或與其它抗生素聯合使用已被證明可以抵御致死劑量的G接種或內毒素接種，現已應用于創傷性失血、嚴重腹內感染、部分肝切除、腦膜炎(球)菌血癥和眼科疾病等一些臨床研究。國內已利用現代分子生物學、生物信息學及計算機分子模擬技術合成BPI小分子肽，并實驗驗證具有較強的生物活性；但藥代動力學研究表明，rBPI₂₃/rBPI₂₁在體內的半衰期太短(＜1h)，將rBPI₂₃/rBPI₂₁與其他功能基因片段嵌合表達融合蛋白來提高其的半衰期并帶有特殊的生物學活性是目前解決此問題的主要方向。