[發明專利]一株具有雙重噬菌體抗性的L-苯丙氨酸生產菌及其選育方法

有效

• 申請號: 201010135604.9
• 申請日: 2010-03-30
• 公開（公告）號: CN102010848A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉龍;王靜;周海巖;李江華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/01;C12N13/00;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種具有雙重噬菌體抗性的微生物及其選育方法，屬于生物工程技術領域。?

背景技術

噬菌體污染是影響氨基酸發酵生產的關鍵因素之一。如果在生產中受到噬菌體的污染，會影響生產率，從而影響企業效益。其來源很多，在相對較長的發酵周期中，無論哪個環節發生污染，都會對整個過程造成影響。多年來，企業在噬菌體在生產過程對噬菌體的防治上積累了大量的經驗，但選育抗噬菌體的生產菌株才是最有效的方法。?

本實驗室前期開發了一株L-苯丙氨酸生產菌WSH-BR42(CCTCC?M?2010008)，該菌株具有噬菌體BP-1(CCTCC?M?2010054)抗性，但在實際生產中發現該菌種又受到了噬菌體BP-2(CCTCC?M?2010055)的污染。?

利用誘變手段篩選抗噬菌體的菌株是選育抗性菌株的方法之一。由于現在所知的誘變方法已有很多，其對機理方面的要求也不高，人們在對誘變方法的選用上已有了很多的經驗。但往往用誘變手段選育菌種具有一定的盲目性，是一件耗時耗力的工作。在篩選抗噬菌體抗性的大腸桿菌方面，本發明提出在誘變后培養階段利用噬菌體淘汰培養的方法，就如何快速有效的獲得目的菌株而言提供了一條新的途徑。?

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一株重組大腸桿菌WSH-BR165（pAP-B03），該菌株具有對重組大腸桿菌易感染噬菌體BP-1（CCTCC?M?2010054，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2010年3月15日，地址：中國武漢，武漢大學，分類學命名為：大腸桿菌噬菌體（Bacteriophage））和BP-2的（CCTCC?M?2010055，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2010年3月15日，地址：中國武漢，武漢大學，分類學命名為：大腸桿菌噬菌體（Bacteriophage））雙重抗性；含有重組質粒，質粒上攜帶L-苯丙氨酸合成酶基因，現已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間2010年1月18日，地址：中國武漢，武漢大學，分類學命名為：大腸桿菌（Escherichia?coli），保藏編號為?CCTCC?M?2010013。?

所述噬菌體BP-1來源于本實驗室前期開發的L-苯丙氨酸生產菌WSH-ZH06(含重組質粒pAP-B03，CCTCC?M?2010009)受到噬菌體污染的裂解液，噬菌體BP-1已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間2010年3月15日，保藏編號為CCTCC?M?2010054；噬菌體BP-2來源于本實驗室開發的L-苯丙氨酸生產菌WSH-BR42(含重組質粒pAP-B03，CCTCCM?2010008)受到噬菌體污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌體BP-1的抗性，但不具有噬菌體BP-2的抗性，噬菌體BP-2已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間2010年3月15?日，保藏編號為CCTCC?M?2010055。?

所述重組質粒為pAP-B03，其上攜帶L-苯丙氨酸合成的關鍵酶CM/PDT和DS的基因pheA^fbr和aroF，其中pheA^fbr基因來源于E.coli?K12的突變株，aroF來源于E.coli?K12(Enhanced?L-phenylalanine?biosynthesis?by?co-expression?of?pheA^fbr?and?aroF^wt.HaiyanZhou，Xianyan?Liao，Tianwen?Wang，Guocheng?Du，Jian?Chen.Bioresource?Technology)。?

本發明所要解決的另外一個技術問題是提供了一種紫外線誘變育種、噬菌體淘汰培養以及分子生物學改造相結合的L-苯丙氨酸生產菌的選育方法。?