[發(fā)明專利]一種油葵的基因轉化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010134462.4
• 申請日: 2010-03-29
• 公開（公告）號: CN101787372A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發(fā)明（設計）人: 楊靜慧;劉艷軍;張偉玉
• 申請（專利權）人: 天津農(nóng)學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和植物育種領域，尤其是一種油葵的基因轉化方法。

背景技術

油用向日葵(簡稱油葵)是近30年來總產(chǎn)量增長最快的世界三大油料作物之一，年增長率7.1％，世界上油葵的主產(chǎn)國是阿根廷、法國、其次是中國。我國的油葵主要集中在東北三省、內(nèi)蒙古、新疆和正在迅速發(fā)展的陜西、山西和河北等省、自治區(qū)。油葵的籽實含油率一股在46％左右，高的可達50％以上，出油率在42％以上。油葵油不含芥酸、硫代葡萄糖甙等對人體有害的物質，但含有豐富的對人體非常有益的不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量65％左右，油酸25％左在，亞油酸能調(diào)節(jié)新陳代謝、維持血壓平衡、能溶解脫離沉積在腸壁上的多余膽固醇，因而可降低血壓、預防動脈硬化。由于含有和亞油酸比例相當?shù)木S生素E，可阻止亞油酸的迅速氧化。另外還含有大量的維生素A、類胡羅卜素等人體必需的營養(yǎng)物質，在促進毛細血管增生、改善血液循環(huán)、延緩細胞衰老、防止夜盲癥等方面具有重要作用。油葵油油質純正、無異味、芳香可口、易被吸收。作為食用油、油葵在全國僅占8％，而香港占70％。隨著我國國民經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，油葵油的消費將呈上升趨勢。

油葵作為重要的油料植物，近些年在我國已大面積應用，有關的育種研究也有報道，但關于利用基因工程技術進行育種的研究還沒有。由于油葵多為野生，種質資源不豐富，品種性狀單一，所以利用常規(guī)育種技術很難得到理想的育種目標。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種育種速度快、方法簡單的油葵的基因轉化方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種油葵的基因轉化方法，其轉化方法的步驟是：

(1)取油葵試管苗組織作為外植體；

(2)取農(nóng)桿菌C58C1的一個單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，待其OD值為0.2-0.6時，取出并浸染油葵試管苗組織外植體；

(3)將上述浸染過的油葵試管苗外植體放在含有2-5mg/L除草劑的分化培養(yǎng)基上進行再生芽的誘導，該分化培養(yǎng)基為MS+KT0.25mg/L+IAA0.5mg/L，外植體長度為2-3cm，接種50-150塊，培養(yǎng)條件為20-30℃、20-26h光照、光強1500-2500lx，從接種后每0-14天繼代一次，生成轉化苗；

(4)將上述除草劑篩選的轉化苗轉入生根培養(yǎng)基，其生根培養(yǎng)基的構成為1/2MS+IAA0.5mg/L，待轉化苗苗長到2-5cm高時即可移栽到花盆中。

而且，所述接種后最佳時間為每7天繼代一次。

而且，所述分化培養(yǎng)基上的除草劑濃度最佳為3mg/L。

而且，所述油葵試管苗組織外植體最佳為莖段部分。

而且，所述除草劑包括草丁膦。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

本發(fā)明建立一套油葵的基因轉化方法，分別對篩選標記(除草劑)濃度、不同轉化外植體的選擇、采用不同的繼代時間進行了確定，本方法表明在培養(yǎng)基中加入3mg/L的除草劑濃度下，以油葵的莖段為外植體，在每周繼代一次的條件下可獲得最高的轉化效率，為油葵的各種基因轉化奠定基礎。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。

油葵(試管苗)及轉化所用帶抗鹽轉錄因子HS的質粒(HS/pCB302)和農(nóng)桿菌C58C1均由天津農(nóng)學院園藝系園林植物實驗室提供。以下實施例中用藥品為MS培養(yǎng)基；6-BA試劑；NAA試劑；蔗糖；瓊脂粉；肌醇；蒸餾水；NaOH試劑。

一種油葵的基因轉化方法，其轉化方法是：

(1)取生長健壯的油葵試管苗，將莖段作為外植體；

(2)取農(nóng)桿菌C58C1的一個單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，待其OD值為0.4時，取出并浸染油葵試管苗外植體；

(3)將上述浸染過的油葵試管苗外植體放在含有3mg/L除草劑的分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為MS+KT0.25mg/L+IAA0.5mg/L，進行再生芽的誘導，莖段長度為2-3cm，接種100塊，培養(yǎng)條件為28℃，24h光照，光強2000lx，從接種后每7天繼代一次；除草劑濃度為3mg/L時應該為理想的篩選壓力。當繼代時間為7天時，接種外植體的再生率最高，即獲得的基因轉化率也最高；繼代時間為7天時獲得的轉化效果最好。

(4)將上述除草劑篩選的轉化苗轉入生根培養(yǎng)基上，該生根培養(yǎng)基的構成為1/2MS+IAA0.5mg/L，待轉化苗苗長到3cm高時即可移栽到花盆中。

所述除草劑為：草丁膦，草丁膦是標記基因為bar基因的篩選藥劑的一種。