[發明專利]一種酪氨酸磷酸化肽的純化方法

無效

• 申請號: 201010133263.1
• 申請日: 2010-03-26
• 公開（公告）號: CN102199189A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 鄒漢法;韓廣輝;葉明亮;王春麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明是一種基于β-消除和Michael親核加成反應的酪氨酸磷酸化肽的純化方法，是β-消除和Michael親核加成方法在磷酸化蛋白質組中的應用，β-消除和Michael親核加成反應方法對酪氨酸磷酸化肽段顯示出高的特異性，高的選擇性和高的靈敏度。β-消除和Michael親核加成反應可以實現對酪氨酸磷酸肽的純化，使其能夠應用于蛋白質翻譯后修飾的磷酸化蛋白質組中。通過β-消除和Michael親核加成反應方法消除絲氨酸和蘇氨酸上的磷酸基團，進而利用磷酸肽富集材料從復雜蛋白酶解樣品中純化出酪氨酸磷酸化肽段，結合生物質譜進行大規模酪氨酸磷酸化蛋白質的鑒定和酪氨酸磷酸化位點的確定。

背景技術

蛋白質的翻譯后修飾是蛋白質組中研究的熱點課題。蛋白質磷酸化是最常見、最重要的一種蛋白質的翻譯后修飾方式，是目前已知的信號的主要傳遞方式。蛋白質的磷酸化和去磷酸化幾乎調節著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖、發育和分化，神經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等。蛋白質酪氨酸磷酸化在細胞的信號傳導中起著非常重要的作用。酪氨酸激酶的異常激活可以產生異常的細胞增殖和存活信號進而導致形成腫瘤或癌癥。因此，對于酪氨酸磷酸化的分析十分重要。

由于酪氨酸磷酸化的含量相對于絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的含量低很多，常用的磷酸化富集方法不能有效地對磷酸化的酪氨酸進行選擇性富集。目前，利用抗體免疫親和富集是酪氨酸磷酸化分析的首選。在蛋白質水平上，酪氨酸的抗體很多，富集的效果并不是十分理想；在肽段水平上，抗體P-Tyr-100富集P-Tyr磷酸肽在大規模分析中得到了廣泛的應用。雖然在肽水平上富集P-Tyr磷酸肽效率很高，但是較低的序列覆蓋率導致蛋白質鑒定困難，溶劑和溫度要求苛刻以及昂貴的試劑價格限制了它的廣泛應用。而將β-消除和Michael親核加成反應方法應用于純化酪氨酸磷酸化肽未見報道，與常規商品化的P-Tyr-100免疫親和方法富集方法相比，β-消除和Michael親核加成反應方法顯示出同樣高的特異性，選擇性和靈敏度。

下列非專利文獻(文獻1.Oda，Y.等，“Enrichment?analysis?ofphosphorylated?proteins?as?a?tool?for?probing?the?phosphoproteome”，《NatureBiotechnology》，P?379-382(2001年)；文獻2.Kinoshita，E.等，“Phosphate-binding?tag，a?new?tool?to?visualize?phosphorylated?proteins”，《Molecular?&?Cellular?Proteomics》，P749-757(2006年)；文獻3.He，T.等，“Quantitation?of?phosphopeptides?using?affinity?chromatography?and?stableisotope?labeling，《Journal?of?the?American?Society?For?MassSpectrometry》，P363-373(2004年)；文獻4.Van?der?Veken等，“Development?of?a?novel?chemical?probe?for?the?selective?enrichment?ofphosphorylated?serine-and?threonine-containing?peptides.”，《Chembiochem》，P2271-2280(2005年)；文獻5.Thaler，F.等，“A?new?approach?tophosphoserine?and?phosphothreonine?analysis?in?peptides?and?proteins：chemicalmodification，enrichment?via?solid-phase?reversible?binding，and?analysis?bymass?spectrometry”，《Analytical?and?Bioanalytical?Chemistry》，P366-373(2003年)；文獻6.Stevens，S.M.等，“Enhancement?of?phosphoproteinanalysis?using?a?fluorescent?affinity?tag?and?mass?spectrometry”，《RapidCommunications?in?Mass?Spectrometry》，P2157-2162(2005年))中記載將β-消除和Michael親核加成反應用于絲氨酸和蘇氨酸磷酸肽或蛋白的分離和純化。而β-消除和Michael親核加成反應用于酪氨酸磷酸肽的富集和純化，上述非專利文獻中未作任何記載，也未作任何啟示。