[發(fā)明專利]黃單胞菌、制備方法及其生產(chǎn)耐溫型黃原膠多糖的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010132122.8
• 申請日: 2010-03-25
• 公開（公告）號: CN101906390A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王新綱;司書鋒;孫正艷;陳健
• 申請（專利權(quán)）人: 淄博中軒生化有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12N13/00;C12P19/06;C12R1/64
• 代理公司: 濟南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 宋玉霞

1.一種黃單胞菌Xanthomonas?sp.S-96#，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號是：CGMCCNo.3624。

2.如權(quán)利要求1所述的一種黃單胞菌的制備方法，其特征在于，包括黃單胞菌菌懸液的制備、亞硝基胍誘變、紫外線誘變、搖瓶篩選步驟，挑選發(fā)酵液粘度較高，耐溫性能好的菌落，分離上述黃單胞菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種黃單胞菌的制備方法，其特征在于，其詳細步驟為：

①.?黃單胞菌菌懸液的制備：

將黃單胞菌接種于種子搖瓶中，在28±1℃的條件下，振蕩培養(yǎng)18-24小時，，將種子液多次離心并用緩沖液洗滌后制成菌懸液，其中種子培養(yǎng)基各組分按重量配比為：蔗糖0.8-1.2%?，牛肉膏0.2-0.5%，酵母粉0.3-0.8%，調(diào)節(jié)PH到7.0±0.2；

②.?亞硝基胍誘變

在菌懸液中加入溶解好的亞硝基胍處理1-1.5小時，將處理過的菌懸液多次離心洗滌后稀釋涂布于平板上，36-38℃條件下培養(yǎng)三天；

③．紫外線誘變

挑取亞硝基胍誘變后生長健壯、良好的菌落，搖瓶培養(yǎng)后再制成菌懸液，吸取5-8ml菌懸液置于帶有磁力攪拌器的直徑6cm的平板上，在暗光下用15W的紫外燈照射10-12min，然后涂布于培養(yǎng)皿上，在暗光下36-38℃培養(yǎng)三天；

④．搖瓶篩選

挑選紫外燈誘變后培養(yǎng)皿上健壯飽滿、濕潤的大菌落進行發(fā)酵搖瓶篩選，發(fā)酵搖瓶配方：蔗糖3.5-4.0%，大豆蛋白0.5-0.8%?，CaCO3?0.2-0.3%,余量為水，調(diào)節(jié)PH到7.0±0.2；

經(jīng)多次傳代后挑選粘度較高，菌苔豐滿，濕潤，有光澤，無不規(guī)則菌苔生成的菌落，分離出上述黃單胞菌。

4.用權(quán)利要求1所述的黃單胞菌生產(chǎn)耐溫型黃原膠多糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：?

(1)種子擴大培養(yǎng)：

①.一級種子罐：

將種子培養(yǎng)基各組分按配比依次投入加好水的一級種子罐中，攪拌均勻使其溶解，采用實消；降溫后，由接種口按0.8-1.2%的比例接入本發(fā)明的菌種，當菌體數(shù)量較多，生長飽滿時轉(zhuǎn)種；?

②.二級種子罐：

將種子培養(yǎng)基各組分按配比依次投入加好水的二級種子罐中，攪拌均勻使其溶解，采用實消；降溫后，將無雜菌的一級種子罐中的種液按1：10比例壓入二級種子罐中，當菌體數(shù)量較多，生長飽滿時轉(zhuǎn)種；

(2)發(fā)酵：按發(fā)酵培養(yǎng)基配比的要求進行配料；將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基壓入發(fā)酵罐中，采用實消；降溫后，在無菌條件下，將二級種子罐中的種液按1：10比例壓入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，當粘度不再升高時停罐，得到發(fā)酵液；

(3)提取：將上述得到的發(fā)酵液升溫到70-80℃維持15-30min然后將發(fā)酵液降溫到30-35℃后，加入到濃度為85-90％的酒精中，使黃原膠多糖呈纖維狀沉淀析出，用離心機分離，真空干燥，然后粉碎包裝，得到本發(fā)明的耐溫型黃原膠多糖。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)耐溫型黃原膠多糖的方法，其特征在于：所述的種子培養(yǎng)基包括按重量計的下列組分：蔗糖0.8-1.2%?，牛肉膏0.2-0.5%，酵母粉0.3-0.8%，余量為水，調(diào)節(jié)PH到7.0±0.2。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)耐溫型黃原膠多糖的方法，其特征在于：所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括按重量計的下列組分：蔗糖3.5-4.0%，大豆蛋白0.5-0.8%?，CaCO₃?0.2-0.3%?,余量為水，調(diào)節(jié)PH到7.0±0.2。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)耐溫型黃原膠多糖的方法，其特征在于：一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐所述的實消，工藝條件為：溫度119-130℃、壓力0.1-0.12MPa，時間25-60min。

8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一權(quán)利要求所述的一種黃單胞菌生產(chǎn)耐溫型黃原膠多糖的方法，其特征在于，其詳細工藝步驟如下：

(1)種子擴大培養(yǎng)：

①.一級種子罐：

將種子培養(yǎng)基各組分按重量配比（蔗糖0.8-1.2%?，牛肉膏0.2-0.5%，酵母粉0.3-0.8%）依次投入加好水的一級種子罐中，攪拌均勻使其溶解，調(diào)節(jié)PH到7.0±0.2；采用實消，溫度119-130℃、壓力0.1-0.12MPa，時間25-60min；降溫至28±1℃時，在無菌條件下，由接種口按1%的比例接入本發(fā)明的菌種，接種后菌種在28±1℃的條件下，培養(yǎng)18-24小時，當菌體數(shù)量較多，生長飽滿時轉(zhuǎn)種；?

②.二級種子罐：

將種子培養(yǎng)基各組分按重量配比（蔗糖0.8-1.2%?，牛肉膏0.2-0.5%，酵母粉0.3-0.8%）依次投入加好水的二級種子罐中，攪拌均勻使其溶解，調(diào)節(jié)PH值到7.0±0.2；采用實消、溫度119-130℃、壓力0.1-0.12MPa，時間25-60min；降溫至28±1℃時，在無菌條件下，將無雜菌的一級種子罐中的種液按1：10比例壓入二級種子罐中；接種后菌種在28±1℃的條件下培養(yǎng)18-24小時，當菌體數(shù)量較多，生長飽滿時轉(zhuǎn)種；?

⑵發(fā)酵：往發(fā)酵罐內(nèi)泵入已配好的發(fā)酵培養(yǎng)基（按重量計）：蔗糖3.5-4.0%，大豆蛋白0.5-0.8%，CaCO₃?0.2-0.3%,余量為水，調(diào)節(jié)PH值到7.0±0.2，采用實消，溫度119-130℃、壓力0.1-0.12MPa，時間25-60min；降溫至28±1℃時，在無菌條件下，將二級種子罐中的種液壓入發(fā)酵罐中，28±1℃的條件下培養(yǎng)70±2小時，當粘度不再升高時停罐，得到發(fā)酵液;

(3)提取：開蒸汽將上述得到的發(fā)酵液升溫到70-80℃維持15-30min，然后開冷卻水將發(fā)酵液降溫到30-35℃，按1：3比例加入濃度為85-90％的酒精，混合攪拌15-30min,使黃原膠多糖呈纖維狀沉淀析出，將沉淀物料泵入離心機進行固液分離，分離的廢酒精液回蒸餾塔儲罐，可以進行多次酒精沉淀步驟進行提純，固體物料經(jīng)擠壓脫水后在真空條件下70-80℃干燥，然后粉碎包裝，得到本發(fā)明的黃原膠多糖。