[發明專利]一種無氧環境中分離純化綠藻氫酶的方法

無效

• 申請號: 201010131253.4
• 申請日: 2010-03-24
• 公開（公告）號: CN102199577A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 張衛;彥飛;陳兆安;陸洪斌;曹旭鵬;薛松
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及一種分離純化綠藻氫酶的方法，即在無氧操作袋及層析柱構成的無氧環境中，經硫酸銨沉淀，凝膠過濾層析和離子交換層析等步驟分離純化綠藻氫酶。

背景技術

綠藻制氫是目前制氫領域中的研究熱點。綠藻在光合作用II過程中能將水分解成氧氣、質子和電子，電子經過光合系統I的電子傳遞鏈及鐵氧化還原蛋白傳遞給氫酶，氫酶將質子還原為氫氣。氫酶在這個過程中起著關鍵作用，但氫酶對氧氣非常敏感，在有微量氧氣存在時就會失活。近年來，國際上包括美國、德國、荷蘭、法國和日本等國家已經從淡水綠藻萊茵衣藻、小球藻、斜生柵藻及海水綠藻綠球藻中分離純化得到幾種鐵氫酶蛋白，對其進行生化、分子遺傳、定向進化和活性誘導機制的研究，已經并取得了明顯進展。例如Zhang等發現淡水萊茵衣藻在缺硫連續光照條件下，由于硫元素的缺乏，使半胱氨酸合成受阻，進而導致PS?II上的D1蛋白無法及時修復，降低PS?II的光化學活性及產氧量。當體系中的產氧速率和呼吸耗氧速率相等時，就造成了一個厭氧的環境，使衣藻的氫酶得以表達，實現連續產氫。

但以上氫酶的提取工藝是在巨大的無氧操作裝置中完成，存在以下缺點：所有儀器、試劑集中在無氧裝置內，導致全部操作步驟均需通過手套進行操作，很不方便；每次放入或取出物品均需要通入大量保護氣，成本很高；若裝置出現泄露現象，里面的氫酶將很快接觸氧氣，無法立即得到有效保護，會導致氫酶失活。而將小型無氧操作袋與層析柱串聯的提取工藝，在國內外均未報道。

發明內容

本發明目的在于提供一種工藝簡單，操作方便，能有效構建無氧環境，用于綠藻氫酶分離純化的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

將小型無氧操作袋與層析柱串聯起來，構建無氧環境。將試劑、器皿放入無氧操作袋中，所有試劑均加入連二亞硫酸鈉以除去溶氧，用高速珠磨法破碎綠藻細胞，粗酶液經硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析和離子交換層析純化后，獲得純氫酶。

具體操作步驟如下：

1)取生長對數后期，鮮重為10g藻細胞，重新懸浮于50-200mL滅菌海水或磷酸緩沖液中，得藻液，置于密閉玻璃瓶中；通氮氣5-15min，排除容器中氧氣后，在黑暗中誘導3-12h；

2)取玻璃瓶于無氧操作袋中，反復充N₂、抽真空三次后，將藻液分裝于密封離心管中，離心濃縮，去上清后重懸于10-15mL?Tris-Hcl緩沖液中；在重懸液中加入5-15g、-20-4℃預冷玻璃珠，用渦旋震蕩器混旋3-5次破碎綠藻細胞，每次1-2min，兩次之間在冰上靜置1-2min，然后在0-4℃下離心，取上清棄沉淀；

3)將10-15mL上清液用Tris-Hcl緩沖液稀釋至15-30mL，緩慢加固體(NH₄)₂SO₄沉淀蛋白，在0-4℃下離心，取上清棄沉淀；

4)在步驟(3)離心后獲取的上清液中緩慢加入固體(NH₄)₂SO₄沉淀蛋白，在0-4℃下離心，收集沉降下的蛋白，重新懸浮于4-8mL?Tris-Hcl緩沖液中；

5)將4-8mL酶液用蠕動泵打入填裝有Sephacryl?S-100HR的凝膠過濾層析柱中，用150-300mL?Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測有氫酶活性的組分；

6)將步驟(5)中的有氫酶活性的組分用蠕動泵打入填裝有DEAE-Sehparose?CL-6B的離子交換層析柱中，用200-400mL?Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測收集有氫酶活性的組分，即純綠藻氫酶。

Tris-Hcl緩沖液濃度為50mM，pH7.5-8.5；磷酸緩沖液濃度為50mM，pH7.0-8.0。

取生長對數后期，濃度約1-6×10⁶cells/mL的綠藻，1500-4000r/min離心濃縮2-5min，倒掉上層海水后，得步驟(1)所用的藻細胞。

步驟(1)中海水綠藻采用滅菌海水重懸，淡水綠藻采用磷酸緩沖液重懸；

步驟(2)中第一步離心條件為1500-4000r/min，2-5min；玻璃珠的直徑為0.5-1mm；0-4℃下的離心條件為10000-12000r/min，10min；

步驟(3)中加入固體(NH₄)₂SO₄至30％-50％飽和度；離心條件為13000-16000r/min，10min；