[發明專利]一種無氧環境中分離純化綠藻氫酶的方法

無效

• 申請號: 201010131253.4
• 申請日: 2010-03-24
• 公開（公告）號: CN102199577A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 張衛;彥飛;陳兆安;陸洪斌;曹旭鵬;薛松
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種綠藻氫酶分離純化的方法，其特征在于：此分離純化過程始終在無氧環境中進行，采用無氧操作袋與層析柱串聯系統，將試劑、器皿放入無氧操作袋中，層析柱置于無氧操作袋外部，無氧操作袋與層析柱通過管路串聯；

具體操作步驟如下：

1)取生長對數后期，鮮重為10g綠藻藻細胞，重新懸浮于50-200mL滅菌海水或磷酸緩沖液中，得藻液，置于密閉玻璃瓶中；通氮氣5-15min，排除玻璃瓶中氧氣后，在黑暗中誘導3-12h；

2)取玻璃瓶于無氧操作袋中，反復充N₂抽真空2-6次后，將藻液分裝于密封離心管中，離心濃縮，去上清后重懸于10-15mL?Tris-Hcl緩沖液中；在重懸液中加入5-15g、-20-4℃預冷玻璃珠，用渦旋震蕩器混旋3-5次破碎綠藻細胞，每次1-2min，兩次之間在冰上靜置1-2min，然后在0-4℃下離心，取上清棄沉淀；

3)將10-15mL上清液用Tris-Hcl緩沖液稀釋至15-30mL，緩慢加固體(NH₄)₂SO₄沉淀蛋白，在0-4℃下離心，取上清棄沉淀；

4)在步驟(3)離心后獲取的上清液中緩慢加入固體(NH₄)₂SO₄沉淀蛋白，在0-4℃下離心，收集沉降下的蛋白，重新懸浮于4-8mL?Tris-Hcl緩沖液中；

以上步驟2)-4)均于無氧操作袋中進行，所用試劑、器皿均放入無氧操作袋中；

5)將4-8mL酶液用蠕動泵打入填裝有Sephacryl?S-100HR的凝膠過濾層析柱中，用150-300mL?Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測有氫酶活性的組分；

6)將步驟(5)中的有氫酶活性的組分用蠕動泵打入填裝有DEAE-Sehparose?CL-6B的離子交換層析柱中，用200-400mL?Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測收集有氫酶活性的組分，即純綠藻氫酶。

2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：

取生長對數后期，濃度約1-6×10⁶cells/mL的綠藻，1500-4000r/min離心濃縮2-5min，倒掉上層海水后，得藻細胞。

3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)中綠藻為海水綠藻采用滅菌海水重懸，為淡水綠藻采用磷酸緩沖液重懸。

4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中第一步離心條件為1500-4000r/min，2-5min；玻璃珠的直徑為0.5-1mm；0-4℃下的離心條件為10000-12000r/min，10min。

5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)中加入固體(NH₄)₂SO₄至30％-50％飽和度；離心條件為13000-16000r/min，10min。

6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)中加入固體(NH₄)₂SO₄至60％-80％飽和度；離心條件為13000-16000r/min，10min。

7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：Tris-Hcl緩沖液濃度為50mM，pH7.5-8.5；磷酸緩沖液濃度為50mM，pH7.0-8.0。

8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(6)中先用100-200mL?50mM?pH7.5-8.5的Tris-Hcl緩沖液沖洗，再用100-200mL含有0.1-0.3M?Kcl的50mM?pH7.5-8.5的Tris-Hcl緩沖液沖洗。

9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：所述試劑滅菌海水或磷酸緩沖液、Tris-Hcl緩沖液均用高純氮氣鼓氣5-15min，再加入終濃度20-60mM連二亞硫酸鈉除去溶氧。