[發(fā)明專利]一種重組耐熱醛縮酶基因工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010131009.8
• 申請(qǐng)日: 2010-03-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102329764A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝恬;裴曉林;王秋巖;黃黎鋒;李誠(chéng)璐;謝開(kāi)林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/60;C12N15/63;C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組耐熱醛縮酶基因工程菌，及其在發(fā)酵制備耐熱醛縮酶中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

醇醛縮合反應(yīng)(Aldol?condensations)可以形成新的C-C化學(xué)鍵，增長(zhǎng)碳鏈，是一類重要的有機(jī)合成反應(yīng)。在有機(jī)合成中，此反應(yīng)需要低溫誘導(dǎo)(-70℃)，且需要大量的有機(jī)溶劑參與，對(duì)環(huán)境和安全造成潛在的危害。生物酶催化的不對(duì)稱醇醛縮合反應(yīng)可以在中性pH值和室溫條件下進(jìn)行，其替代有機(jī)反應(yīng)的應(yīng)用越來(lái)越得到研究者的關(guān)注。醛縮酶(Aldolase)作為該反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可以小分子化合物為底物，不對(duì)稱合成復(fù)雜的大分子。同時(shí)，生物酶具有高度區(qū)域選擇的特性，能夠容易避開(kāi)對(duì)碳水化合物中的活潑的羥基的保護(hù)，更為突出的特性是在催化C-C鍵合成的同時(shí)醛縮酶可以引入新的手性中心。醛縮酶是生物代謝途徑中關(guān)鍵酶，其中一類醛縮酶(DERA)，可以乙醛為底物，連續(xù)催化醇醛縮合反應(yīng)。此醛縮酶可以用于2，4，6-三脫氧己糖化合物的合成，該化合物是多種他汀類藥物合成的關(guān)鍵中間體。醛縮酶催化的縮合反應(yīng)具有很強(qiáng)的綠色屬性，對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)工藝的綠色化學(xué)改造有著重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，生物酶催化工藝的應(yīng)用得到全世界政府和研究者的普遍關(guān)注，但是現(xiàn)階段缺乏高效的商品生物酶制劑限制了該工業(yè)的發(fā)展。這種狀況主要體現(xiàn)在兩方面：高效的生物酶和經(jīng)濟(jì)可行的酶制劑生產(chǎn)工藝。另外，生物酶在有機(jī)催化反應(yīng)中最突出的缺點(diǎn)是其穩(wěn)定性較差，即對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性較低，易變性失活。研究工作已證明，大量來(lái)源于嗜熱微生物的生物酶蛋白顯示出較高的熱穩(wěn)定性，對(duì)有機(jī)溶劑具有較高的耐受力。大腸桿菌(E.coli)是目前最常用的宿主細(xì)胞，大量的生物蛋白質(zhì)已通過(guò)基因工程手段在其細(xì)胞內(nèi)得到異源過(guò)量表達(dá)。由于大腸桿菌的生理特性，大部分重組蛋白總是在其細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)間合成，其總生產(chǎn)速率與菌體密度密切相關(guān)。因此，高細(xì)胞密度培養(yǎng)技術(shù)有利于提高目的蛋白的表達(dá)量和生產(chǎn)速率，已在重組蛋白的生產(chǎn)工藝中得到廣泛應(yīng)用。

目前，國(guó)外已有關(guān)于不同醛縮酶基因的發(fā)現(xiàn)，以及在藥物合成中應(yīng)用的報(bào)道。美國(guó)科學(xué)家Wong?C.H.等人主要集中于醛縮酶(DERA)的研究，包括基因序列、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化等方面，還未涉及到來(lái)源于嗜熱微生物醛縮酶(DERA)的研究。在國(guó)內(nèi)，還沒(méi)有關(guān)于耐熱醛縮酶(DERA)的研究報(bào)道，只有極少數(shù)研究者或機(jī)構(gòu)進(jìn)行其它醛縮酶的研究。另外，中國(guó)專利檢索目錄關(guān)于各種醛縮酶的研究，申請(qǐng)者幾乎全是國(guó)外研究機(jī)構(gòu)。因此，利用我國(guó)豐富的環(huán)境資源自主開(kāi)發(fā)新型的耐熱醛縮酶具有重要的意義。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種耐熱醛縮酶的基因工程菌株，并優(yōu)化其高密度培養(yǎng)生產(chǎn)方法，提高酶蛋白的生產(chǎn)速率，降低其生產(chǎn)成本。

為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種重組耐熱醛縮酶基因工程菌，由如下方法獲得：構(gòu)建含有醛縮酶基因(Dera)序列的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組耐熱醛縮酶基因工程菌。

具體的，所述醛縮酶基因(Dera)序列如下：