[發(fā)明專(zhuān)利]一種制備App菌影的方法及App菌影裝載巴氏桿菌抗原制備亞單位疫苗的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010130901.4
• 申請(qǐng)日: 2010-03-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101934072A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金天明;孫穎;劉田生;高靜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津農(nóng)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61K39/116
• 分類(lèi)號(hào): A61K39/116;A61K39/102;A61K39/02;A61K39/39;A61P31/04;C12N15/33;C12N15/31;C12N15/55;C12N15/74;C12N1/21
• 代理公司: 天津市鼎和專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 12101
• 代理人: 朱瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)，是一種利用E.coli-App穿梭載體pMC-Express和雙基因裂解制備App菌影的方法及利用App菌影裝載巴氏桿菌抗原OmpH外膜蛋白制備亞單位疫苗的方法。?

背景技術(shù)

胸膜肺炎放線桿菌(App)和多殺性巴氏桿菌是豬呼吸道常見(jiàn)的重要致病菌，引起的臨床癥狀很難區(qū)分，常呈混合感染。大量流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，由于抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌細(xì)菌耐藥性普遍存在，特別是高耐藥菌株的出現(xiàn)，致使多數(shù)藥物對(duì)耐藥菌的臨床療效降低或無(wú)效。目前常用的豬傳染性胸膜肺炎疫苗有滅活苗、弱毒苗和亞單位疫苗；豬肺疫疫苗有滅活苗及弱毒苗。各類(lèi)疫苗均存在優(yōu)缺點(diǎn)：滅活苗成本低、安全、方便，但交叉保護(hù)能力差；弱毒苗交叉保護(hù)及免疫效果好，但有返毒危險(xiǎn)；亞單位疫苗安全，制備方便，卻需與適當(dāng)佐劑配合，才能發(fā)揮最佳效果，且交叉保護(hù)能力不如弱毒苗，加之滅活過(guò)程造成抗原表位的缺失或抗原性減弱，免疫效果不確定且副作用較大等缺點(diǎn)。因此，開(kāi)展新型疫苗的研究變得尤為必要和緊迫。?

目前，利用菌影技術(shù)制備疫苗已在多國(guó)進(jìn)行，但尚處于研發(fā)階段，還未有產(chǎn)品推向市場(chǎng)。菌影技術(shù)被用于多種革蘭氏陰性菌疫苗制備試驗(yàn)，效果良好，但存在裂解不完全的問(wèn)題。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，通過(guò)引入金黃色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)，使其與裂解蛋白E串聯(lián)表達(dá)，提高裂解效率，制備APP菌影。將多殺性巴氏桿菌保護(hù)性抗原OmpH外膜蛋白導(dǎo)入APP菌影，以菌影為載體，發(fā)揮靶?向作用，從而實(shí)現(xiàn)并達(dá)到二聯(lián)疫苗的免疫效果。?

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種利用E.coli-App穿梭載體pMC-Expres?s和雙基因裂解制備App菌影的方法，包括以下步驟：?

1)通過(guò)PCR擴(kuò)增噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN編碼序列，通過(guò)柔性氨基酸linker串聯(lián)上述雙基因得到E-15aalinker-SN，將E-15aa?linker-SN與含有λpL/pR-cI857溫控啟動(dòng)子的表達(dá)載體pBV220構(gòu)建溫控重組表達(dá)載體pBV-E-15aa?linker-SN；?

2)利用引物擴(kuò)增溫控雙基因裂解盒插入到E.coli-App穿梭載體pMC-Express中，構(gòu)建重組穿梭表達(dá)載體；?

3)采用電轉(zhuǎn)化法將重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入App菌體，通過(guò)升溫誘導(dǎo)制備App菌影，菌影凍干保存。?

具體包括步驟如下：?

1)E、SN和E-15aa?linker-SN基因的擴(kuò)增?

根據(jù)噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN編碼序列設(shè)計(jì)引物：?

E1：5’-CAG?GAATTC?ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(EcoRI)?

E2：5’-GGC?GTCGAC?TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3’(SalI)?

SN1：5’-CAG?GAATTC?GCAACTTCAACTAAAAAT-3’(EcoRI)?

SN2：5’-GGC?GTCGAC?TTATTGACCTGAATCAGCG-3’(SalI)?

再設(shè)計(jì)含15個(gè)柔性氨基酸linker的引物，用于將裂解基因E和核酸酶A基因SN串聯(lián)：?

E2’：5’-TGC?AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3’?

SN1’：5’-GAG?GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT-3’?

以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板，分別采用E1、E2和E1、E2’為上、下引物，擴(kuò)增裂解基因E，得到兩組產(chǎn)物，后者在E基因后帶有l(wèi)inker；以?金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923基因組DNA為模板，分別以SN1、SN2和SN1’、SN2為上、下游引物，擴(kuò)增基因SN，得到兩組產(chǎn)物，后者于SN基因前帶有l(wèi)inker；以帶有l(wèi)inker的E和SN基因?yàn)槟０?，以E1和SN2為引物，通過(guò)降落PCR法，得到雙基因串聯(lián)產(chǎn)物E-15aa?linker-SN；?

2)重組表達(dá)質(zhì)粒及雙基因裂解體系的構(gòu)建?