[發明專利]一種制備App菌影的方法及App菌影裝載巴氏桿菌抗原制備亞單位疫苗的方法

有效

• 申請號: 201010130901.4
• 申請日: 2010-03-24
• 公開（公告）號: CN101934072A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 金天明;孫穎;劉田生;高靜
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: A61K39/116
• 分類號: A61K39/116;A61K39/102;A61K39/02;A61K39/39;A61P31/04;C12N15/33;C12N15/31;C12N15/55;C12N15/74;C12N1/21
• 代理公司: 天津市鼎和專利商標代理有限公司 12101
• 代理人: 朱瑜

1.一種利用E.coli-App穿梭載體pMC-Express和雙基因裂解制備App菌影的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)通過PCR擴增噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN編碼序列，通過柔性氨基酸linker串聯上述雙基因得到E-15aalinker-SN，將E-15aa?linker-SN與含有λpL/pR-cI857溫控啟動子的表達載體pBV220構建溫控重組表達載體pBV-E-15aa?linker-SN；

2)利用引物擴增溫控雙基因裂解盒插入到E.coli-App穿梭載體pMC-Express中，構建重組穿梭表達載體EAlysis-vector；

3)采用電轉化法將重組穿梭表達質粒導入App菌體，通過升溫誘導制備App菌影，菌影凍干保存。

2.根據權利要求1所述的利用E.coli-App穿梭載體pMC-Express和雙基因裂解制備App菌影的方法，其特征在于，包括步驟如下：

1)E、SN和E-15aa?linker-SN基因的擴增

根據噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN編碼序列設計引物：

E1：5’-CAG?GAATTC?ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(EcoRI)

E2：5’-GGC?GTCGAC?TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3’(SalI)

SN1：5’-CAG?GAATTC?GCAACTTCAACTAAAAAT-3’(EcoRI)

SN2：5’-GGC?GTCGAC?TTATTGACCTGAATCAGCG-3’(SalI)

再設計含15個柔性氨基酸linker的引物，用于將裂解基因E和核酸酶A基因SN串聯：

E2’：5’-TGC?AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3’

SN1’：5’-GAG?GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT-3’

以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板，分別采用E1、E2和E1、E2’為上、下引物，擴增裂解基因E，得到兩組產物，后者在E基因后帶有linker；以金黃色葡萄球菌標準株ATCC25923基因組DNA為模板，分別以SN1、SN2和SN1’、SN2為上、下游引物，擴增基因SN，得到兩組產物，后者于SN基因前帶有linker；以帶有linker的E和SN基因為模板，以E1和SN2為引物，通過降落PCR法，得到雙基因串聯產物E-15aa?linker-SN；

2)重組表達質粒及雙基因裂解體系的構建

將獲得的E、SN和E-15aa?linker-SN與pMD-18T載體連接，轉化感受態E.coli?DH5α，抗性平板篩選陽性菌落后，提質粒酶切鑒定，獲得重組克隆質粒pMD-E、pMD-SN和pMD-E-15aa?linker-SN；雙酶切pMD-E、pMD-E-15aalinker-SN和溫控表達載體pBV220，經連接、轉化、篩選重組子、提質粒酶切鑒定后，分別獲得重組表達載體pBV-E和pBV-E-15aa?linker-SN，通過菌體裂解試驗，對溫控裂解體系功能進行評價；

3)E.coli-App重組穿梭表達載體的構建

根據Genbank中λpL/pR-cI857溫控啟動子序列及pBV220質粒序列設計溫控裂解盒上游引物λpL/pR-cI857FP，與SN基因下游引物SN2’結合，以pBV-E-15aa?linker-SN為模板，對該融合基因進行擴增，引物序列如下：

λpL/pR-cI857?FP：5’-ATAGGGCCC?TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(ApaI)

SN2’：5’-CGC?GGATCC?TTATTGACCTGAATCAGCGT-3’(BamHI)

擴增產物與pMD-18T載體連接，轉化、篩選重組子，提質粒酶切鑒定后得到重組克隆載體攜帶的溫控裂解盒；用ApaI和BamHI分別酶切穿梭載體pMC-Express和溫控裂解盒克隆載體，膠回收試劑盒回收目的片段，以T₄DNA連接酶將線性化載體與目的片段進行連接，轉化感受態細胞，篩選重組子，提質粒酶切鑒定后獲得重組穿梭表達載體；

4)App重組菌的構建及菌影的制備

采用電轉化法將重組穿梭表達質粒導入App菌體，通過升溫誘導制備App菌影，以pMC-Express轉化App菌為對照，測定溫控雙基因裂解系統對App菌的裂解特性，并鏡檢升溫前后菌體的形態變化，獲得App菌影。