[發明專利]抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201010130043.3
• 申請日: 2010-03-23
• 公開（公告）號: CN101805408A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發明（設計）人: 胡風慶;戴有金;胡靜
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K39/085;A61P35/00;A61P7/02;A61K38/45
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.一種抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，其特征在于：由序列表SEQ?ID?NO.1 所示的SAK氨基酸序列、序列表SEQ?ID?NO.2所示的linker氨基酸序列 和序列表SEQ?ID?NO.3所示的SEC2氨基酸序列構成，linker將SEC2和 SAK連接在一起，得到氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的嵌合蛋白 SAK-linker-SEC2或氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示的嵌合蛋白 SEC2-linker-SAK。

2.一種利用大腸桿菌表達系統生產權利要求1所述的抗腫瘤溶栓雙 效嵌合蛋白的方法，其特征在于步驟如下：

1)構建嵌合基因sak-linker-sec2，其DNA序列如SEQ?ID?NO.9所示；

2)將得到的嵌合基因sak-linker-sec2，經酶切后，插入到載體質粒 pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點，構建出表達嵌合蛋白SAK-linker-SEC2的 質粒pET28a-sak-linker-sec2；

3)將質粒pET28a-sak-linker-sec2轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中， 得到重組大腸桿菌；

4)將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液吸光度 值達到0.6時，在30℃條件下用1mM?IPTG誘導4～5小時，之后離心收 集菌體細胞；

5)用超聲波破碎菌體細胞，功率：200-300W；處理時間：6×9sec， 9sec間隔；處理后，6000rpm離心10min，去除不溶性細胞碎片，收集 上清液；

6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經梯度洗脫和濃縮除鹽，得到 嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

3.一種利用大腸桿菌表達系統生產權利要求1所述的抗腫瘤溶栓雙 效嵌合蛋白的方法，其特征在于步驟如下：

1)構建嵌合基因sec2-linker-sak，其DNA序列如SEQ?ID?NO.12所示；

2)將得到的嵌合基因sec2-linker-sak，經酶切后，插入到載體質粒 pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點，構建出表達嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的 質粒pET28a-sec2-linker-sak；

3)將質粒pET28a-sec2-linker-sak轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中， 得到重組大腸桿菌；

4)將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液吸光度 值達到0.6時，在30℃條件下用1mM?IPTG誘導4～5小時，之后離心收 集菌體細胞；

5)用超聲波破碎菌體細胞，功率：200-300W；處理時間：6×9sec， 9sec間隔；處理后，6000rpm離心10min，去除不溶性細胞碎片，收集 上清液；

6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經梯度洗脫和濃縮除鹽，得到 嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

4.權利要求1所述的嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應用。