[發(fā)明專利]逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010129278.0
• 申請日: 2010-02-19
• 公開（公告）號: CN101851635A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發(fā)明（設計）人: 黃晨;孫世仁;杜銳;許國雙;朱軍;張鵬;宋揚;李曼;加慧衛(wèi);劉曉渭;王漢民;陳威
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;C12Q1/02;A61K49/00;A61K38/17;A61P13/12;G01N27/447;G01N33/50;G01N33/68
• 代理公司: 西安吉盛專利代理有限責任公司 61108
• 代理人: 鮑燕平

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，具體涉及基因克隆、外源基因在原核細胞中的表達、目的蛋白質(zhì)的制備方法以及活性檢測，特別是逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測。

背景技術

(1)逆轉(zhuǎn)腎纖維化治療相關研究及存在的問題：

腎臟纖維化是不同病因(包括炎癥、損傷、藥物、糖尿病和遺傳因素、衰老等)所導致慢性腎臟疾病的最終共同結(jié)局。各種進展性腎臟疾病，無論其原發(fā)病如何，最終都將導致腎臟纖維化，進展為終末期腎功能衰竭，并必須依靠透析或腎移植維持生命。因此，研究腎臟纖維化的發(fā)病機制、探索能夠緩解腎臟纖維化進程或逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化的有效治療手段、延緩終末期腎衰的發(fā)生是腎臟疾病研究領域亟待解決的重要臨床問題。

隨著對腎臟纖維化發(fā)生的分子機制逐漸深入，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforminggrowth?factor-β1，TGF-β1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone?morphorgenic?protein，BMP)及其下游的smad信號轉(zhuǎn)導通路在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用。因此，通過阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路和(或)增強BMP7信號來逆轉(zhuǎn)或延緩腎臟纖維化成為當前研究的熱點，并已在大量的體外及動物實驗中得以證實。然而，目前阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路多借助于基因治療，因其需要載體介導，可控性差，轉(zhuǎn)導效率有限，安全性低等問題以及可能加重腎臟炎癥反應而難以被臨床所接受。而激活BMP7信號轉(zhuǎn)導通路要求BMP7使用劑量非常高，且重組BMP7價格昂貴，使得應用重組BMP7治療腎臟纖維化也難以在臨床廣泛使用。因此，開發(fā)一種新的能有效阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路，且安全性高，毒副作用小的蛋白藥物，將為臨床防治腎臟纖維化帶來新的希望。

(2)腎臟纖維化治療的研究進展

目前尚未有能夠應用于臨床的腎臟纖維化有效治療手段。在臨床前研究中阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路和激活BMP7信號轉(zhuǎn)導通路卻都能有效緩解腎臟纖維化并加速轉(zhuǎn)歸。

①阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路緩解腎臟纖維化

使用TGF-β1反義核酸、TGF-β1特異性小干擾RNA(small?interference?RNA，siRNA)、II型TGF-β受體特異性siRNA和II型TGF-β受體胞外區(qū)均可在單側(cè)輸尿管梗阻等模型動物抑制腎臟進行性間質(zhì)纖維化。使用反義核酸封閉TGF-β1下游產(chǎn)物CTGF表達也可明顯緩解腎臟纖維化。

使用TGF-β1受體ALK5抑制劑IN-1130治療大鼠單側(cè)輸尿管梗阻腎臟纖維化模型可顯著降低TGF-β1mRNA、I型膠原蛋白mRNA和磷酸化smad2蛋白水平、羥脯氨酸含量和腎臟膠原蛋白總含量，并可下調(diào)α平滑肌肌動蛋白(α-smooth?muscle?actin，α-SMA)和纖維連接蛋白表達，從而抑制腎臟纖維化進程。

以上資料表明阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路可以達到治療、緩解腎臟纖維化的目的。

然而反義核酸和siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定性較差；可溶性受體胞外區(qū)空間結(jié)構(gòu)復雜，必須采用基因治療手段給藥；ALK5抑制劑IN-1130僅能抑制smad3磷酸化，不能高效阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路。還有研究顯示TGF-β1是個雙刃箭，它另有較強的抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用。使用TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠制備梗阻性腎病和糖尿病性腎病模型發(fā)現(xiàn)腎臟炎癥顯著減輕，其機制為TGF-β1通過上調(diào)smad7誘導IκBα表達并進一步阻斷NFκB激活。深入研究發(fā)現(xiàn)，過度表達smad7可抑制smad2/3激活，從而可以阻止TGF-β1、血管緊張素II等誘發(fā)膠原蛋白產(chǎn)生，并可在多種動物模型，包括梗阻性腎病和糖尿病性腎病顯著緩解和抑制腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。根據(jù)這些研究結(jié)果我們不難看出目前已經(jīng)建立的阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路的策略在抑制腎臟纖維化的同時也對機體對抗腎臟炎癥的作用通路產(chǎn)生了抑制作用，因此難于在臨床推廣應用。

②BMP7在治療腎臟纖維化中的應用

1997年Vukicevic等人報道使用劑量250ug/kg的BMP7可顯著減輕缺血再灌注誘發(fā)的大鼠急性腎小管壞死并加速腎小管再生。2000年Hruska等發(fā)現(xiàn)使用劑量300ug/kg的BMP7治療單側(cè)尿道完全梗阻所致梗阻性腎病大鼠模型，可明顯抑制腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化。2003年Zeisberg等發(fā)現(xiàn)使用劑量300ug/kg的BMP7治療MRLlpr/lpr狼瘡性腎炎小鼠和COL4A3-/-奧爾波特綜合征小鼠也可顯著抑制腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，此后又發(fā)現(xiàn)相同劑量的BMP7可顯著加速急性腎小球腎炎小鼠模型腎小管間質(zhì)性損傷回歸。