[發(fā)明專利]逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測(cè)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010129278.0
• 申請(qǐng)日: 2010-02-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101851635A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-10-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃晨;孫世仁;杜銳;許國(guó)雙;朱軍;張鵬;宋揚(yáng);李曼;加慧衛(wèi);劉曉渭;王漢民;陳威
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;C12Q1/02;A61K49/00;A61K38/17;A61P13/12;G01N27/447;G01N33/50;G01N33/68
• 代理公司: 西安吉盛專利代理有限責(zé)任公司 61108
• 代理人: 鮑燕平

1.逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測(cè)，其特征在于：它包括

1)合成含酶切位點(diǎn)編碼PTD-SARA的基因序列；

2)PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及構(gòu)建；

3)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；

4)重組蛋白的純化；

5)重組蛋白的體外穿膜活性檢測(cè)；即重組PTD-SARA穿過(guò)HKC細(xì)胞胞膜和核膜的能力；加入不同劑量的重組PTD-SARA，SARA和空白對(duì)照，檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)胞漿和胞核中的表達(dá)量；

6)重組蛋白的體外生物學(xué)活性檢測(cè)：即重組PTD-SARA抑制TGF-β1對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HKC轉(zhuǎn)分化的影響；加入不同劑量的重組PTD-SARA，再用TGF-β1刺激HKC細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)和表皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)以及間皮細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)量；

7)重組蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)：按建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎梗阻模型，以PTD-SARA為受試藥物，SARA、注射用生理鹽水為對(duì)照藥物，以實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腎臟纖維化為檢測(cè)指標(biāo)，確定受試藥物的逆轉(zhuǎn)纖維化效果；以實(shí)驗(yàn)前后大鼠腎臟功能為檢測(cè)指標(biāo)，計(jì)算血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，確定受試藥物的逆轉(zhuǎn)腎臟功能的效果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測(cè)，其特征在于：所述的重組蛋白的體外穿膜活性檢測(cè)；分別加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量的重組PTD-SARA，SARA和空白對(duì)照，免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞漿和胞核內(nèi)PTD-SARA的表達(dá)量；濃度為5ng/ml時(shí)，相對(duì)于內(nèi)參PTD-SARA組、SARA組以及空白組細(xì)胞內(nèi)SARA的表達(dá)分別為0.25，0.17，0.08；濃度為10ng/ml時(shí)，相對(duì)于內(nèi)參PTD-SARA組、SARA組以及空白組細(xì)胞內(nèi)SARA的表達(dá)分別為0.37，0.23，0.07；濃度為20ng/ml時(shí)，相對(duì)于內(nèi)參PTD-SARA組、SARA組以及空白組細(xì)胞內(nèi)SARA的表達(dá)分別為0.34，0.25，0.08；PTD-SARA組的穿膜效果顯著高于SARA組，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳濃度。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測(cè)，其特征在于：所述的分別加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量的重組PTD-SARA，再用10ng/ml的TGF-β1刺激HKC細(xì)胞，此時(shí)觀察表皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin以及間皮細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA；空白對(duì)照組、SARA組和PTD-SARA組為5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml；相對(duì)于內(nèi)參表皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)量分別為：0.08，0.26，0.45，0.56，0.54；間皮細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)量分別為0.4，0.31，0.13，0.08，0.10。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測(cè)，其特征在于：所述的重組蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)，按建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎梗阻模型，以PTD-SARA為受試藥物，SARA、注射用生理鹽水為對(duì)照藥物，以實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腎臟纖維化為檢測(cè)指標(biāo)，確定受試藥物的逆轉(zhuǎn)纖維化效果；以實(shí)驗(yàn)前后大鼠腎臟功能為檢測(cè)指標(biāo)，計(jì)算血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，確定受試藥物的逆轉(zhuǎn)腎臟功能的效果。