[發明專利]一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個體的方法

無效

• 申請號: 201010127859.0
• 申請日: 2010-03-19
• 公開（公告）號: CN101838695A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 韋平;金元昌;韋信賢;趙子軼;李婭
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 王素娥

技術領域

本發明屬生物學領域，具體是一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個體的方法。

背景技術

過去選定馬立克氏病(MD)抗病品系主要用攻毒幸存者的繁殖或/和后裔測定。例如Cornell?1968年使用此方法進行多代選擇，在第4代獲得了用于科學研究的康乃爾馬立克氏病抗病系和易感系。方法雖然簡單，但需要專門的攻毒環境，基礎群數量大，以及繁瑣的后裔測定，因此育種成本高。

發明內容

為了克服現有技術的不足本發明提供一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個體的方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個體的方法，建立和利用快速鑒定馬立克氏病(MD)抗性/易感單倍體的半巢式PCR(snPCR)法，可以簡單、快速、方便地鑒定MD抗性/易感單倍體，進而鑒定出MD抗性雞個體。該方法操作按以下步驟進行：

1.樣品RNA的提取

無菌翅靜脈采集雞血，分離雞外周血淋巴白細胞(PBLs)，按產品說明書方法使用Trizol?RNA抽提試劑盒提取上述組織的總RNA；

2.cDNA的合成

取RNA樣品14.5μL，加入25pm?BF基因外下游引物1μL，引物序列為5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，70℃5min，置于-20℃5min；然后加入5μL5×RT-Buffer，2μL10mM?dNTP，200U?M-MLV逆轉錄酶，25U?Rnasin并混勻，37℃放置1h，96℃作用5min，最終得25μL?cDNA，保存于-20℃備用；

3.snPCR第一輪擴增BF基因可變剪接部分——外顯子7

設計一對外引物：外上游引物5`-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3`，外下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，用于擴增BF基因的第6外顯子、第7外顯子、第8外顯子以及3`非翻譯區3`-UT的編碼外顯子，PCR反應體系：10×PCR?buffer?5μL、10mM?dNTP?1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，滅菌三蒸水補足50μL，反應循環參數：95℃預變性5min，35個循環：95℃變性30sec、61℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min，產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果并拍照，擴增結果如僅有195bp片段的單倍體，初步定為抗性單倍體；擴增結果如有195bp和162bp片段的單倍體，初步定為易感單倍體；

4.snPCR第一輪擴增產物的克隆、序列測定

對雞的PBLs第一輪snPCR擴增產物進行克隆、序列測定：用1.5％的瓊脂糖凝膠分離PCR產物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，純化產物與pMD₁₈-T載體連接后轉化到大腸桿菌DH₅α感受態細胞，提取質粒DNA測序，所有目的帶測序結果應為BF基因的相應片斷；

5.snPCR第二輪擴增BF基因可變剪接部分——外顯子7

設計一對內引物：內上游引物5`-TACAACATTGCGCCCGGG-3`，內下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，內上游引物序列為第6外顯子末端15個堿基和第8外顯子前3個堿基，因此，它恰好只能結合前面提到的162bp片斷，而不能結合前面提到的195bp片斷，PCR反應體系：10×PCR?buffer?5μL、10mM?dNTP?1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，滅菌三蒸水補足50μL。反應循環參數：95℃預變性5min，35個循環：95℃變性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min。產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果并拍照，擴增結果為陽性，即有141bp片段的單倍體，定為易感單倍體；擴增結果為陰性，即無141bp片段的單倍體，定為抗性單倍體，此個體即相應地的為MD抗性雞。

本發明與現有技術比較的有益效果是：