[發明專利]一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個體的方法

無效

• 申請號: 201010127859.0
• 申請日: 2010-03-19
• 公開（公告）號: CN101838695A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 韋平;金元昌;韋信賢;趙子軼;李婭
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 王素娥

1.一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個體的方法，其特征在于，該方法操作按以下步驟進行：

1)樣品RNA的提取

無菌翅靜脈采集雞血，分離雞外周血淋巴白細胞(PBLs)，按產品說明書方法使用Trizol?RNA抽提試劑盒提取上述組織的總RNA；

2)cDNA的合成

取RNA樣品14.5μL，加入25pm?BF基因外下游引物1μL，引物序列為5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，70℃5min，置于-20℃5min；然后加入5μL?5×RT-Buffer，2μL?10mM?dNTP，200U?M-MLV逆轉錄酶，25U?Rnasin并混勻，37℃放置1h，96℃作用5min，最終得25μL?cDNA，保存于-20℃備用；

3)snPCR第一輪擴增BF基因可變剪接部分——外顯子7

設計一對外引物：外上游引物5`-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3`，外下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，用于擴增BF基因的第6外顯子、第7外顯子、第8外顯子以及3`非翻譯區3`-UT的編碼外顯子，PCR反應體系：10×PCR?buffer?5μL、10mM?dNTP?1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，滅菌三蒸水補足50μL，反應循環參數：95℃預變性5min，35個循環：95℃變性30sec、61℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min，產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果并拍照，擴增結果如僅有195bp片段的單倍體，初步定為抗性單倍體；擴增結果如有195bp和162bp片段的單倍體，初步定為易感單倍體；

4)snPCR第一輪擴增產物的克隆、序列測定

對雞的PBLs第一輪snPCR擴增產物進行克隆、序列測定：用1.5％的瓊脂糖凝膠分離PCR產物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，純化產物與pMD18-T載體連接后轉化到大腸桿菌DH₅α感受態細胞，提取質粒DNA測序，所有目的帶測序結果應為BF基因的相應片斷；

5)snPCR第二輪擴增BF基因可變剪接部分——外顯子7

設計一對內引物：內上游引物5`-TACAACATTGCGCCCGGG-3`，內下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，內上游引物序列為第6外顯子末端15個堿基和第8外顯子前3個堿基，因此，它恰好只能結合前面提到的162bp片斷，而不能結合前面提到的195bp片斷，PCR反應體系：10×PCR?buffer?5μL、10mM?dNTP?1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，滅菌三蒸水補足50μL。反應循環參數：95℃預變性5min，35個循環：95℃變性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min。產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果并拍照，擴增結果為陽性，即有141bp片段的單倍體，定為易感單倍體；擴增結果為陰性，即無141bp片段的單倍體，定為抗性單倍體，此個體即相應地的為MD抗性雞。