[發(fā)明專利]遺傳性玻璃體淀粉樣變性致病基因的檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010126966.1
• 申請(qǐng)日: 2010-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101775442A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周建獎(jiǎng);謝淵;趙艷;王鮮;李芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 貴陽(yáng)中工知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 52106
• 代理人: 劉安寧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸的測(cè)定方法，具體而言涉及遺傳性玻璃體淀粉樣變性致病基因的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

人類遺傳資源是研究疾病相關(guān)基因的寶貴材料，近年來(lái)國(guó)際上在遺傳性結(jié)腸癌、乳腺癌和糖尿病基因定位與克隆方面的重大進(jìn)展，我國(guó)克隆的高頻耳聾、遺傳性乳光牙本質(zhì)、兒童白內(nèi)障和短指基因等都利用了疾病家系或特殊人群遺傳資源，這充分說(shuō)明了人類基因資源的重要性。目前對(duì)遺傳性疾病家系的收集和致病基因的研究已成為是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和焦點(diǎn)之一，每年近百個(gè)人類遺傳病的疾病基因被克隆、被專利保護(hù)。我國(guó)人口占世界總?cè)藬?shù)的1/5，具有豐富的人類遺傳資源，充分利用國(guó)際人類基因組研究的結(jié)果與我國(guó)豐富的疾病和遺傳資源，是疾病相關(guān)基因研究的關(guān)鍵。

近年來(lái)，人們?cè)谘芯窟z傳性疾病的致病基因方面取得了一些成果，例如中國(guó)專利申請(qǐng)件00819646.X號(hào)《檢測(cè)遺傳性乳光牙本質(zhì)的突變基因dspp的方法》、200410027623.4號(hào)《Leber’s遺傳性視神經(jīng)病的定量檢測(cè)方法》、200510006097.8號(hào)《Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法》、200610078706.5號(hào)《單核苷酸多態(tài)性試紙條快速檢測(cè)方法及其試紙條》、200680037747.8號(hào)《核酸等溫?cái)U(kuò)增方法和使用核酸和信號(hào)探針同時(shí)等溫?cái)U(kuò)增的核酸檢測(cè)方法》、200810204771.7號(hào)《Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片及其制備與應(yīng)用》等。但迄今為止，尚無(wú)遺傳性玻璃體淀粉樣變性致病基因相關(guān)的專利申請(qǐng)件。

玻璃體淀粉樣變性是一種罕見(jiàn)的玻璃體變性，它可獨(dú)立發(fā)病，也可以表現(xiàn)為系統(tǒng)性淀粉樣變性的眼部受累，常伴家族史，其遺傳方式為常染色體顯性遺傳，但外顯率各有不同。主要癥狀為視力下降及黑影，漂浮感，眼部檢查可見(jiàn)玻璃混濁，其間雜有灰色顆粒狀物，晶狀體后囊可見(jiàn)的“足盤(pán)樣”混濁附著。玻璃體切除術(shù)后病理檢查結(jié)果顯示玻璃體呈剛果紅染色陽(yáng)性.電鏡下發(fā)現(xiàn)纖維絲狀物可明確診斷。淀粉樣變性是一種臨床綜合征，可累及多種組織、器官，玻璃體受累較少見(jiàn)，而遺傳性單純玻璃體樣變性更為少見(jiàn)，目前在我國(guó)僅見(jiàn)病例報(bào)道5篇，國(guó)外也少有報(bào)道，其致病基因至今并不十分清楚。國(guó)外研究報(bào)道認(rèn)為玻璃體淀粉樣變性可能與轉(zhuǎn)甲蛋白(Transthyretin，TTR)的基因突變有關(guān)，其中在多個(gè)遺傳性玻璃體淀粉樣變性的家系中，最常見(jiàn)的是met30點(diǎn)突變，尚有TTR-Ala-71、TTR-Ser-84、TTR-Ile-33、TTR-Asp-84、TTR-Asp-18、TTR-Glu-54、TTR-Ser-44等位點(diǎn)的變異，在我國(guó)陳凌燕等報(bào)道了一個(gè)TTR-Arg-83突變可能是玻璃體淀粉樣變性發(fā)病的一個(gè)新突變位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種遺傳性玻璃體淀粉樣變性致病基因的檢測(cè)方法，從而為治療該遺傳性疾病的研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)條件。

發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)研究，提供的遺傳性玻璃體淀粉樣變性致病基因的檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)DNA的提取：由外周血有核細(xì)胞中提取基因組DNA；

(2)轉(zhuǎn)甲蛋白(TTR)基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增：查詢TTR基因全序列，應(yīng)用primer?premier?5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增TTR基因4個(gè)外顯子的引物，并合成，得出引物序列；

(3)電泳檢測(cè)：將擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚藍(lán)以5∶1混合，2％含EB瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外分析儀觀察并拍照記錄結(jié)果；

(4)測(cè)序及結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物即為擴(kuò)增引物；

(5)致病基因鑒定：選擇無(wú)關(guān)個(gè)體作為對(duì)照，(PCR)擴(kuò)增轉(zhuǎn)甲蛋白(TTR)基因第3外顯子并進(jìn)行測(cè)序，即可鑒定出致病基因。

上述方法的第一步所述提取DNA的方法是酚/氯仿抽提法。

上述方法的第二步所述查詢轉(zhuǎn)甲蛋白(TTR)基因全序列是通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)進(jìn)行的；所述引物序列列入TTR基因擴(kuò)增引物序列表。

上述方法的第三步所述電泳是在200V下進(jìn)行30min。

上述方法的第四步所述測(cè)序是采用310型測(cè)序儀進(jìn)行的。

上述方法的第五步中，所述無(wú)關(guān)個(gè)體選用150個(gè)。

申請(qǐng)人在貴州省一個(gè)遺傳性玻璃體淀粉樣變性家系中發(fā)現(xiàn)了致病基因的新突變位點(diǎn)，即轉(zhuǎn)甲蛋白(TTR)基因的第3個(gè)外顯子103位編碼甘氨酸的密碼子GGC突變?yōu)?G＞C)GC雜合狀態(tài)，CGC編碼賴氨酸，該突變?yōu)槭澜缡状伟l(fā)現(xiàn)。