[發(fā)明專利]一種快速培育純合抗蟲兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍(lán)的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010125939.2
• 申請日: 2010-03-16
• 公開（公告）號: CN101822156A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉凡;趙秀樞;張曉東;張月云
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: A01G1/00
• 分類號: A01G1/00;A01H4/00;A01N65/08;A01P13/00;A01P7/04;C05G3/00;C05G3/02
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速培育純合抗蟲兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍(lán)的方法。

背景技術(shù)

觀賞羽衣甘藍(lán)(Brassica?oleracea?var.acephala)，屬十字花科二年生草本植物，是蕓薹屬甘藍(lán)種的園藝變種。以觀葉為主，其葉片形態(tài)美觀多變，心葉色彩絢麗如花，整個植株形如盛開的牡丹花，人們形象地稱之為“葉牡丹”。其抗寒性很強(qiáng)，能耐受-8℃左右的低溫，近來在許多城市，尤其是長江流域及黃河以南城市，已成為秋冬至早春的主要景觀地被植物。我國目前種子基本依靠進(jìn)口，國內(nèi)稀有育種工作。

觀賞羽衣甘藍(lán)的部分生長期處于蟲害發(fā)生嚴(yán)重季節(jié)，一方面害蟲咬食的結(jié)果，造成了觀賞性的嚴(yán)重破壞，另一方面，大量噴施殺蟲劑，也易造成環(huán)境污染及害蟲抗藥性的形成。此外，作為觀賞植物，通常大片栽種于戶外露地，人工除草是一個耗時耗工的勞動。因此培育抗蟲、抗除草劑的觀賞羽衣甘藍(lán)具有重要的社會及經(jīng)濟(jì)價值。

在甘藍(lán)類作物中，幾乎不存在抗蟲種質(zhì)，更不存在抗除草劑種質(zhì)。采用基因工程手段，引入抗蟲及抗除草劑基因，是培育抗蟲兼抗除草劑品種的最直接、有效的手段，而且由于是單基因的引入，也保證了其觀賞性狀不受影響。

目前國際上使用較多的殺蟲基因有來自蘇云金桿菌的Bt基因，也有部分工作中采用了來自植物的蛋白酶抑制劑基因，而這兩個基因的殺蟲機(jī)理不同。將不同殺蟲機(jī)理的殺蟲蛋白基因同時導(dǎo)入同一受體植物，有可能提高植物的抗蟲性，并延緩昆蟲對殺蟲蛋白產(chǎn)生耐受性。國際上使用較多的抗除草劑基因是來自于細(xì)菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因，它編碼對除草劑Basta中有效成分PPT(Phosphinothricin)的抗性。

在優(yōu)良育種材料中建立高效組織培養(yǎng)離體再生體系是開展基因工程種質(zhì)改良的基礎(chǔ)。我們已經(jīng)在幾份優(yōu)良育種材料中建立了高頻率的不定芽誘導(dǎo)及植株再生技術(shù)(趙秀樞等，2009)，而國內(nèi)外尚未見利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲、抗除草劑觀賞羽衣甘藍(lán)的有關(guān)報道。

甘藍(lán)類作物具有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。生產(chǎn)中使用的種子均為雜交一代。在雜交育種中，首先必須獲得純合的雙親材料，常規(guī)育種需要經(jīng)過6-10年時間。由于植物的花粉細(xì)胞(小孢子細(xì)胞)僅具有一套染色體，通過小孢子培養(yǎng)可以一步獲得雙單倍體純合植株，僅需1-2年時間，能大大加速育種進(jìn)程。我們已經(jīng)建立了觀賞羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)技術(shù)，并獲得了相應(yīng)的國家發(fā)明專利(ZL?2006?1?0112997.5)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的方法。

本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的方法，包括如下步驟：用含有目的基因的重組農(nóng)桿菌侵染甘藍(lán)的子葉，再進(jìn)行共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。

上述過程中，所述甘藍(lán)的子葉為帶柄子葉；所述柄的長度為1mm-4mm；所述柄的長度具體為1mm、2mm或4mm。

上述過程中，所述侵染包括如下步驟：將所述甘藍(lán)的子葉置于所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液中，浸泡3min-5min，得到侵染后的子葉。

上述過程中，所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液的OD₆₀₀值為0.3-0.5。

上述過程中，所述共培養(yǎng)的方法包括如下步驟：將所述侵染后的子葉置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為22℃-27℃且黑暗的條件下培養(yǎng)2天；

所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素(即VB1)、鹽酸吡哆辛(即VB6)、6-芐氨基腺嘌呤(即6-BA)、α-萘乙酸(即NAA)、蔗糖、瓊脂、乙酰丁香酮和水組成；