[發(fā)明專利]LRRC55基因甲基化定量檢測方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010125657.2
• 申請(qǐng)日: 2010-03-16
• 公開（公告）號(hào): CN101967514A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李兆申;高軍;呂順莉;杜奕奇;龔燕芳;黃浩杰;王小瑋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海德昭知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31204
• 代理人: 丁振英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地講，涉及一種核酸的檢測方法，尤其涉及到LRRC55基因甲基化檢測的方法。

背景技術(shù)

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)基因相互作用，相互影響的過程，CpG島甲基化異常是這一漸成過程發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，它包括高甲基化和甲基化不足兩種類型。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，LRRC55(leucine?rich?repeat?containing?55，GeneID：219527)在胰腺癌中存在高甲基化，且該基因在癌組織甲基化率明顯高于癌旁組織，鑒于LRRC55的高甲基化于胰腺癌的密切關(guān)系，促使我們建立一種新的LRRC55甲基化程度的定量檢測方法，此方法可有助于深入研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制和診斷治療。

目前DNA的檢測方法很多，其中甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法、重亞硫酸鹽處理后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序檢測(BSP)和重亞硫酸鹽處理后甲基化特異性PCR檢測(MSP)是應(yīng)用最普遍的方法中的三種。

甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法是經(jīng)典的甲基化分析方法，主要根據(jù)一些限制性內(nèi)切酶不能切開甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳動(dòng)物DNA中，只有CG相連的胞嘧啶能夠被甲基化，因此，在酶切位點(diǎn)內(nèi)包含CG序列的限制性內(nèi)切酶就會(huì)遇到問題。這種方法所使用的兩個(gè)經(jīng)典酶對(duì)是HPaII-Msp?I(CCGG)和Sma?I-Xma?I(CCCGGG)。由于第二對(duì)限制酶識(shí)別序列非常罕見，所以一般都用HPa?II-Msp?I(CCGG)。兩個(gè)酶都識(shí)別CCGG序列，而當(dāng)其中的胞嘧啶甲基化時(shí)，HPaII不能夠?qū)⑵淝虚_，利用Hpa?II-Msp?I的這種屬性處理DNA，這就使得HPa?II-Msp?I能夠作為快速甲基化分析的工具，隨后進(jìn)行Southern或PCR擴(kuò)增分離產(chǎn)物，明確甲基化狀態(tài)。該方法存在下列缺點(diǎn)：(1)由于CG不僅僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；(2)只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測方法的結(jié)果才有意義；(3)相對(duì)而言，Southern方法較復(fù)雜，且需要樣本的量大；(4)存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題；(5)不適用于混合樣本。

重亞硫酸鹽處理后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序檢測(BSP法)，是根據(jù)重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不變。基因組DNA經(jīng)亞硫酸鹽處理后，設(shè)計(jì)BSP引物并擴(kuò)增目的的片段，此時(shí)尿嘧啶(U)全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶(T)，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可靠性及精確度都很高，能檢測到目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，缺點(diǎn)是需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣，費(fèi)用也比較高。

重亞硫酸鹽處理后甲基化特異性PCR檢測(MSP法)，亞硫酸氫鹽可以氧化去除基因組DNA中胞嘧啶的氨基，在此反應(yīng)中除m5C外其余胞嘧啶均可被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁＨ缓髮⑦@些靶序列用特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過擴(kuò)增的DNA，所有尿嘧啶均轉(zhuǎn)化為可檢測的胸腺嘧啶，只有m5C以胞嘧啶形式被擴(kuò)增。這種方法是目前所使用的在給定基因組靶序列中分析m5C最常用的方法。可以檢測到每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況。基于此原理，發(fā)展出亞硫酸氫鹽去氨基反應(yīng)后，結(jié)合PCR擴(kuò)增的快速方法來檢測m5C，稱為甲基化特異PCR(MSP)，這種MSP方法運(yùn)用，特別設(shè)計(jì)的針對(duì)甲基化的和非甲基化序列的引物，從而得到特異擴(kuò)增的甲基化或非甲基化靶序列。目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到CpG島甲基化檢測。此方法適用范圍很廣，可以檢測包括已知的、接近PCR引物的及限制性酶切范圍的CpG雙核昔酸序列的甲基化狀況。MSP是目前應(yīng)用最廣泛的CpG島甲基化檢測方法，可檢出比例為千分之一的甲基化片段。可靠的MSP，關(guān)鍵在于引物，其引物設(shè)計(jì)需兩個(gè)已知的、包含多個(gè)完全甲基化或非甲基化CpG位點(diǎn)的區(qū)域，但具有上述特征的CpG島不多，限制了MSP的使用。該方法存在下列缺點(diǎn)：(1)這種方法只能作定性研究，即只能明確是否存在甲基化；若要求定量，則需用其他的方法進(jìn)行進(jìn)一步檢測；(2)若要區(qū)分甲基化引物與非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物量的不同，需要嚴(yán)格控制PCR反應(yīng)的條件及循環(huán)數(shù)。

目前尚無LRRC55基因甲基化相關(guān)的定量檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于為克服上述各種方法的缺點(diǎn)，從而提供一種針對(duì)LRRC55基因甲基化程度的操作簡便、敏感性高的定量檢測方法。