[發明專利]LRRC55基因甲基化定量檢測方法

無效

• 申請號: 201010125657.2
• 申請日: 2010-03-16
• 公開（公告）號: CN101967514A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 李兆申;高軍;呂順莉;杜奕奇;龔燕芳;黃浩杰;王小瑋
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 丁振英

1.一種LRRC55基因甲基化定量檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

A、待檢樣本處理：用QIAGEN?EpiTect?Bisufite?Kit^TM試劑盒對待檢樣本的DNA進行重亞硫酸鹽處理，用作擴增模板；

B、分別制備ACTB參照基因的標準品和LRRC55靶基因的標準品：

設計并合成ACTB參照基因的BSP引物：

ACTB?BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT?3′

ACTB?BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA?3′

設計并合成LRRC55靶基因的MSP引物：

LRRC?55BF：5′GGTTTAGAAAAATGAGTTTG′3′

LRRC55BR：5′CCTTCATCCCAACATCCCTT?3′

ACTB參照基因進行BSP反應的條件：95℃預變性10min；95℃變性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40個循環；

LRRC55靶基因進行BSP反應的條件：95℃預變性10min；95℃變性30s.57.75℃退火30s.72℃延伸30s，共40個循環；

PCR產物進行純化，連接入pMD18-T?Vector，然后電擊法轉化至E.coliDH5α、工程菌，測序正確的重組菌進行擴增，應用試劑盒抽提純化質粒，分別制備出ACTB參照基因的標準品和LRRC55靶基因的標準品；

C、在BSP擴增片段內設計MSP引物及探針

LRRC?55MF：5’GTAGGAAAATAGGTAGCGTTAGGTC?3’

LRRC55MR：5’AAAAAAACCGAAAATAATACCACG??3’

D、LRRC55基因甲基化的定量檢測：

設計并合成ACTB的探針和LRRC55的探針：

ACTB探針：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB

LRRC55探針：FAM-ATAGTAGGTGGGTAAGGG-MGB

對重亞硫酸鹽處理過的待檢樣本DNA，分別同時進行實時熒光定量PCR、條件是：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50個循環；檢測ACTB和LRRC55基因的拷貝數；待檢樣本DNA中LRRC55基因的拷貝數除以ACTB基因的拷貝數，即為待檢樣本中LRRC55基因甲基化程度的定量值。

2.根據權利要求1所述的一種LRRC55基因甲基化定量檢測方法，其特征在于其中的待檢樣本包括活檢組織、穿刺液積細胞、尿液、糞便、外周全血、外周血清/漿、胰液。