[發(fā)明專利]全基因合成雞α干擾素基因及蛋白表達(dá)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010125002.5
• 申請日: 2010-03-16
• 公開（公告）號: CN101928711A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姚火春;張煒;潘子豪;胡偉娟
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/21
• 分類號: C12N15/21;C12N15/63;C12N15/67;C12N1/21;C07K14/56;C12R1/19
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程生物制藥領(lǐng)域，涉及利用全基因合成技術(shù)獲得雞α干擾素基因及其干擾素蛋白的原核表達(dá)。

二背景技術(shù)

目前，隨著我國養(yǎng)雞規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎等雞病毒性疾病所帶來的危害越來越嚴(yán)重，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大的損失。干擾素系統(tǒng)是機(jī)體對抗病毒感染的重要防御系統(tǒng)，當(dāng)干擾素系統(tǒng)被激活后，血清干擾素可以在幾分鐘之內(nèi)擴(kuò)散到身體各器官，而細(xì)胞接觸干擾素只需幾分鐘就可產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)，而且，動物可以在一到三周內(nèi)對其他病毒的重復(fù)感染有抵抗作用。根據(jù)干擾素的氨基酸序列、抗原性和細(xì)胞來源的不同可將其分為2個型：I型干擾素的主要成員為α干擾素和β干擾素，II型干擾素為γ干擾素.而其中α干擾素(IFN-α)以其突出的抗病毒作用而備受人們重視。

由誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然雞IFN-α，因來源少、成本高、純化工藝復(fù)雜等諸多原因而價格昂貴，極大的限制了臨床和科研的應(yīng)用，而利用基因工程技術(shù)選擇一個合適的系統(tǒng)，使其得到高效表達(dá)，生產(chǎn)具有廉價、廣譜抗病毒活性、無毒害、無殘留等優(yōu)點(diǎn)的干擾素已經(jīng)無疑是促使干擾素在獸醫(yī)臨床上推廣應(yīng)用的有效途徑。

三發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的之一在于對雞α干擾素基因序列進(jìn)行密碼子改造后，通過全基因合成技術(shù)合成此序列并構(gòu)建高效表達(dá)載體，實現(xiàn)干擾素在大腸桿菌的高表達(dá)，獲得具有抗病毒活性的雞α干擾素蛋白。

本發(fā)明的另一目的是提供一種通過全基因合成技術(shù)合成的經(jīng)過改造的核酸，其特征在于：所述核酸包含編碼雞α干擾素的閱讀框，并且在該閱讀框內(nèi)全部采用大腸桿菌偏愛的密碼子。

優(yōu)選的，上述閱讀框的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述核酸的重組載體。

本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述重組載體的大腸桿菌。

本發(fā)明還提供一種在原核表達(dá)系統(tǒng)中提高雞α干擾素表達(dá)量的方法，其包含如下步驟：(1)在不改變雞α干擾素氨基酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計其編碼核酸序列，使閱讀框內(nèi)的每個密碼子都采用大腸桿菌偏愛的密碼子；(2)人工合成步驟(1)中設(shè)計的編碼核酸；(3)將步驟(2)合成的核酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；(4)將步驟(3)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

技術(shù)方案

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

(一)雞α干擾素基因的合成

(1)登錄GeneBank，查找編碼雞α干擾素成熟蛋白的基因序列；

(2)利用SignalP?3.0Server軟件預(yù)測此基因序列有無信號肽及其位置；

(3)利用TargetP?1.1Server軟件檢測此信號肽的功能；

(4)將雞α干擾素的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對，根據(jù)密碼子的兼并性，將雞α干擾素密碼子替換為大腸桿菌偏好的密碼子；

(5)將替換后的序列5′、3′端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點(diǎn)，送生物公司進(jìn)行全基因合成；

(二)雞α干擾素的原核表達(dá)

(1)重組質(zhì)粒pET32a-ChIFN-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)；

(2)陽性重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，最佳誘導(dǎo)時間的確定及表達(dá)蛋白可溶性鑒定；

(3)重組陽性菌穩(wěn)定性檢測；

(三)重組雞α干擾素的提取

(1)菌體破碎；

(2)包涵體洗滌；

(3)包涵體變性；

(4)目的蛋白透析復(fù)性及蛋白濃度測定；

(四)重組雞α干擾素抗病毒活性測定

利用微量病變抑制法測定干擾素活性

(1)制備雞胚成纖維細(xì)胞；

(2)接種96孔細(xì)胞板；

(3)濾泡性口炎病毒(VSV)對雞胚成纖維細(xì)胞半數(shù)致死量的測定；

(4)干擾素抗VSV活性測定，將抑制50％細(xì)胞病變的干擾素的最高稀釋度定為1個干擾素單位。

四附圖說明

圖1是重組雞α干擾素蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖

泳道1：誘導(dǎo)表達(dá)前；泳道2-6：誘導(dǎo)表達(dá)1，2，3，4，5小時；泳道7：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量32kD處有增加的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期的蛋白分子量一致(干擾素分子量17.8kD，加上載體本身的融合標(biāo)簽14.3kD)，且在5小時時表達(dá)量最高，所以選用的最佳誘導(dǎo)時間為5小時。

圖2是重組雞α干擾素蛋白可溶性鑒定圖

泳道1：菌體破碎后上清；泳道2：菌體破碎后沉淀；泳道3：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)。