[發明專利]一種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環病毒抗體的方法

有效

• 申請號: 201010122698.6
• 申請日: 2010-03-02
• 公開（公告）號: CN101776687A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 余旭平;胡東建;趙秀玲;郭婧;于洪濤;劉曉寧;孫紅霞;俞永裕;陳維虎
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及一種血清學檢測病毒抗體的方法，特別是涉及一種采 用間接ELISA方法檢測鵝圓環病毒抗體的方法。

背景技術

1999年，德國學者首次報道了鵝圓環病毒(GoCV)感染的病例， 發病鵝群主要表現為死亡率偏高、個體生長速度減慢參差不齊、羽毛 發育不良等癥狀，病理剖解通常僅見輕度的氣囊渾濁，但組織病理學 檢測可見法氏囊、脾臟和胸腺有不同程度的淋巴細胞缺失的特征性病 理變化，其它病變還包括肺、肝、心肌散在的炎性細胞浸潤等，一些 病例中可見法氏囊結構的嚴重破壞，并在法氏囊髓質、皮質和個別囊 上皮細胞內觀察到了嗜堿性的病毒包涵體；經提純和磷鎢酸負染，在 鵝法氏囊、脾、胸腺等組織提取物中觀察到了圓環病毒樣顆粒。此后， Tod、chen等對鵝圓環病毒全基因組序列進行了克隆、測定和序列分 析。

2004年，Ball等用PCR和斑點雜交法(DBH)對匈牙利一些鵝 場的病死鵝樣品進行了檢測，發現用這兩種方法的陽性檢出率分別為 48.1％和24.6％。2005年，Glavits等報道了匈牙利一鵝場爆發西尼羅 河熱與圓環病毒的共感染病例，病死率達14％。2006年英國學者Scott 等應用SFV(Semliki森林病毒)真核表達載體在幼倉鼠腎細胞(Baby Hamster?Kidney?Cell)中表達了GoCV核衣殼蛋白，并以此為抗原， 以兔抗鴨熒光抗體為二抗，建立了間接免疫熒光(IFA)檢測方法， 并應用該方法對英國的一些鵝場進行血清學調查，發現1～6歲鵝的抗 體陽性率為88.6％，30周齡以下的為40.9％。

2005年本實驗室在國內首次從浙江永康禽流感病死鵝的樣品中 檢測到了GoCV，進一步應用PCR方法對從浙江省不同地區的8個 鵝場采集的樣品進行了檢測，并克隆測定了10株GoCV全基因組序 列，進行了GoCV的分子流行病學分析。

除英國學者Scott等建立的IFA外，GoCV的檢測目前主要應用 PCR和斑點雜交等核酸學方法。我們在采用PCR方法開展GoCV檢 測和分子流行病學的調查工作時發現，被檢鵝通常需要屠宰取法氏囊 等淋巴組織樣品進行試驗成功率才高，直接用血清樣品檢測的檢出率 很低，其它核酸學方法如斑點雜交、原位雜交等也會存在同樣的問題。 為更好地開展我國GoCV的流行情況和感染范圍調查，并為進一步開 展GoCV的致病性和免疫機制的研究奠定基礎，有必要建立一種更加 快速、敏感、特異、便于大規模應用且不需要撲殺動物的血清學檢測 診斷方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速、敏感、特異、便于大規模應用且 不需要撲殺動物的血清學檢測鵝圓環病毒抗體的方法，特別是提供一 種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環病毒抗體的方法。

本發明在已建立的鵝圓環病毒重組核衣殼蛋白的原核表達基礎 上，利用羊抗雞二抗的交叉反應性，替代抗鵝二抗，開展了鵝圓環病 毒抗體檢測間接ELISA方法的研究，本發明的技術方案提供一種采 用間接ELISA方法檢測鵝圓環病毒抗體的方法，其采用原核表達的 鵝圓環病毒重組核衣殼蛋白作為ELISA檢測的包被抗原，以HRP- 羊抗雞IgG酶標抗體作為二抗，進行鵝血清GoCV抗體的間接ELISA 方法檢測。

上述原核表達鵝圓環病毒重組核衣殼蛋白的菌株為含融合表達 GoCV外殼蛋白重組質粒pET-28a-ΔCap的BL21(DE3)工程菌，構建 方法見參考文獻：余旭平等，鵝圓環病毒重組核衣殼蛋白的原核表達， 中國預防獸醫學報，2008年7月第30卷第7期，P505-509，其在IPTG 誘導下能融合表達鵝圓環病毒缺失核定位序列的核衣殼蛋白(ΔCap 蛋白)。將含陽性重組表達質粒的工程菌接種于10mL?LB液體培養 基中(含50ug/mL卡那霉素)，37℃振蕩培養過夜，按1％的量轉接 10mL?LB液體培養基(含50ug/mL卡那霉素)，37℃振蕩培養，待OD₆₀₀值達0.6左右，加IPTG至終濃度為1mM，誘導4h。離心收集菌體， 經超聲破碎后離心收集包涵體，分別以含4M尿素、1％Triton?100的 緩沖液對包涵體進行洗滌，重復兩次，最后用8M的尿素溶解包涵體。 離心后取上清，用鎳瓊脂糖凝膠柱進行進一步純化，用咪唑洗脫，具 體操作參照試劑使用說明。