[發明專利]干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列

有效

• 申請號: 201010122423.2
• 申請日: 2010-03-12
• 公開（公告）號: CN101792771A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 張和平;烏日娜;孟和
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/16;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地，涉及一種蛋白編碼序列，特別是一種 干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est?C的蛋白序列。

背景技術

益生菌是指活的微生物，通過攝入充足的數量，對宿主產生一種或多種特 殊且經過論證的功能性健康益處，如可通過調整人體胃腸道內多種微生物群落， 拮抗致病微生物，從而改善腸道環境，可防治消化道疾病，并克服了抗生素應 用帶來的醫源性菌群失調癥等。經過數十年的發展，益生菌的涵義日趨完善， 益生菌數量及保健功效方面也都得到進一步充實，具有益生功效的新菌株不斷 地被篩選和鑒定。干酪乳桿菌就是常見的用于微生物制劑的益生性乳酸菌菌種 之一。干酪乳桿菌分布非常廣泛，多見于牛乳、奶酪、酸奶等乳制品中。干酪 乳桿菌Zhang(Lactobacillus?casei?Zhang)是內蒙古農業大學“乳品生物技術與 工程”教育部重點實驗室從內蒙地區、蒙古國和新疆地區牧民家庭以傳統方法 制作的自然發酵酸馬奶中分離鑒定的眾多乳桿菌中篩選得到。該菌株具有益生 菌的特性及益生功效，是益生菌開發的潛在優良菌種。

細菌中的脂酶能夠催化三脂酰甘油酯鍵的水解反應釋放出短鏈脂肪酸，從 而改酵食品，特別是半硬質干酪的風味和質構。該酶在干酪成熟的過程中可以 維持較高的活力，催化的水解反應能夠水解乳脂肪，生成丁酸、己酸及辛酸等 多種短鏈脂肪酸。許多嗜熱和嗜溫型乳桿菌在發酵的過程中都檢測到具有脂酶 活性。干酪乳桿菌Zhang基因組中編碼的脂酶Est?C(Esterase?C)蛋白的氨基酸 序列在N-端缺乏信號肽序列，屬于胞內酶；編碼基因位于一個由轉錄激活子和 IIA、IIB、IIC、IID四個糖特異性轉運蛋白構成的負責轉運乙酰基糖類的PTS 操縱子上游，這個操縱子與枯草芽孢桿菌的lev操縱子基因組成結構類似。研究 也證明位于脂酶Est?C這個基因下游的PTS操縱子與代謝、攝取酯化糖類有關聯。 在干酪乳桿菌Zhang的耐酸研究中，發現脂酶Est?C是可以被較低的pH值環境 誘導表達，與正常發酵條件下脂酶Est?C的表達量相比有上升趨勢，這也許暗示 脂酶Est?C可以水解特定底物的糖類，幫助細胞適應高酸性環境。

本發明參考其它菌株Est?C基因序列，克隆測序獲得干酪乳桿菌Zhang (Lactobacillus?casei?Zhang)Est?C基因序列，并對不同物種Est?C基因的編碼序 列進行相似性比較，為今后開展Est?C與應激反應的相關研究工作提供基礎資 料。

發明內容

本發明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白Est?C編碼序列，該序列 是干酪乳桿菌Zhang應激密切相關的基因，其核苷酸序列與已公布的干酪乳桿 菌BL23的核酸序列FM177140的核酸序列有99％的相似性。

具體地，本發明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中的熱休克蛋白Est?C的編碼 序列，該序列的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1，

本發明還提供了一種分離出的干酪乳桿菌Zhang中的Est?C蛋白，該蛋白的 氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。

本發明還提供了SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異 多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

本發明還提供了一種干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est?C基因的克隆和測序方 法。該方法包括步驟：(1)PCR引物設計與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提取； (3)目的片斷的PCR擴增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測；(5)目的基因片斷回收 與鑒定；(6)目的基因片斷的克隆與鑒定；(7)測序，其特征在于PCR引物為 SEQ?ID?NO：3(正向)和SEQ?ID?NO：4(反向)，其序列信息如下：

SEQ?ID?NO：3：5’-TAATGACGGTTATTCGTGC-3’

SEQ?ID?NO：4：5’-TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3’

具體地，各個步驟的詳細內容如下：

(1)PCR引物設計與合成

PCR引物對的正向引物和反向引物信息如下：

SEQ?ID?NO：3(正向)：5’TAATGACGGTTATTCGTGC-3’；

SEQ?ID?NO：4(反向)：5’-TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3’；

(2)干酪乳桿菌DNA的提取