[發明專利]干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列

有效

• 申請號: 201010122423.2
• 申請日: 2010-03-12
• 公開（公告）號: CN101792771A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 張和平;烏日娜;孟和
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/16;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

1.一種干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est?C基因的克隆和測序方法，該方法包 括步驟：(1)PCR引物設計與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提取；(3)目的片 斷的PCR擴增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測；(5)目的基因片斷回收與鑒定；(6) 目的基因片斷的克隆與鑒定；(7)測序，其特征在于PCR引物的正向引物為SEQ? ID?NO：3和反向引物為SEQ?ID?NO：4，其序列信息如下：

SEQ?ID?NO：3：5’-TAATGACGGTTATTCGTGC-3’

SEQ?ID?NO：4：5’-TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3’；

其中干酪乳桿菌DNA的提取步驟如下：

細菌培養液5ml，10,000rpm離心1分鐘，棄上清；加入適量溶菌酶溶液， 使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37℃處理30-60分鐘；加入20μl蛋白酶K 溶液，其濃度為20mg/ml，混勻；加220μl緩沖溶液GB，振蕩15秒；70℃放置 30分鐘；加入220μl無水乙醇，充分振蕩15秒；將溶液加入吸附柱中，12,000rpm 離心30秒；加500μl去蛋白液GD，12,000rpm離心30秒，棄廢液；加700μl 漂洗液GW，12,000rpm離心30秒，棄廢液；加500μl漂洗液GW，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液；再次12,000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫數分鐘； 將吸附柱轉入干凈的離心管中，加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘， 12,000rpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘， 12,000rpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA；

其中目的片斷的PCR擴增的擴增體系為：0.2μl?Taq聚合酶，2.5μl?10×PCR 緩沖液，2μl?dNTP，2μl?25mM的MgCl20.2μl?50pM的正向引物，0.2μl?50pM的反 向引物，1μl基因組DNA和17.4μl?ddH₂O，擴增條件為：97℃變性5min；95℃ 30s，55℃30s，72℃30s，如此進行35次循環；72℃延伸10min，4℃保存；

其中瓊脂糖凝膠電泳檢測的步驟為：取PCR產物5μl，同1μl上樣緩沖液混 合均勻，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5μl?DL2000Marker，120V/cm 電壓下電泳30min，電泳結束后，在凝膠成像系統GDS-8000System上留取照片；

其中目的基因片斷回收與鑒定的操作步驟如下：

在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管 中；膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置50℃水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完 全溶化；將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1或CA2中，13,000rpm離心30 秒，倒掉收集管中的液體；將吸附柱放入同一個收集管中，在吸附柱中加入700μl 漂洗液PW，13,000rpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一 個收集管中；在吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm離心30秒，倒掉廢 液；將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除 去漂洗液；將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數分鐘，晾干；將吸附柱放入一個干 凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-70℃水浴預熱的洗脫緩沖液 EB，室溫放置2分鐘；13,000rpm離心1分鐘收集DNA溶液；

其中目的基因片斷的克隆與鑒定的步驟如下：

感受態細胞的制備

挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線；過夜培養后挑取新鮮單菌落， 接種到100ml?LB培養基中，37℃搖菌160轉/分鐘培養2-3小時，至OD₆₀₀達到 0.4-0.5時將菌液移至滅菌預冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘；4,000rpm， 4℃離心10分鐘，回收細菌沉淀；加入20ml經過過濾除菌并經預冷的0.1M?CaCl₂懸浮細菌沉淀；冰浴10-15分鐘后于4,000rpm，4℃離心10分鐘，回收細菌沉 淀；加入4ml?0.1M?CaCl₂懸浮細菌沉淀；該細胞可直接用于轉化實驗；加甘油 至終濃度為15％-20％，混勻，每份分裝成100μl于1.5ml?EP管中，凍存于-70℃ 冰箱中；

回收片段同T載體的連接

首先在EP管中制備下列連接反應液：

然后將上述反應液在16℃反應30分鐘，產物用于轉化感受態細胞；

質粒的轉化

從-70℃冰箱中取出保存的感受態細胞，冰浴助溶；將100μl感受態細胞加 入10μl連接產物，冰浴30分鐘后于42℃水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中 2分鐘；加入400μl液體LB培養基，37℃復活50分鐘后取100μl鋪于LB平板 上，平板含0.1(V/V)的氨芐青霉Amp，X-gal和IPTG；最后于37℃恒溫培養 10-15小時；白色菌斑應含重組質粒；

轉化菌落的PCR鑒定與培養

用記號筆標記轉化培養的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落；將牙簽 頭放入在加有不含模板的PCR反應液的EP管中晃動，進行PCR擴增；將PCR 產物同Marker一起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；得 到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應的單菌落，放入40ml含 0.1％(V/V)的青霉素鈉LB液體培養基中，37℃過夜搖菌培養，用于質粒回收 和測序。