[發明專利]一種抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA及其表達載體和應用

無效

• 申請號: 201010122228.X
• 申請日: 2010-03-11
• 公開（公告）號: CN101892226A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 井長勤;李曉娟;張秀華;高啟禹;明紅;王天云;豐慧根
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;A61K48/00;A61K31/713;A61P3/04
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 陳浩

技術領域

本發明涉及一種抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA，還涉及一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體及其構建方法，同時還涉及所述siRNA在制備減肥藥物中的應用和所述載體作為減肥藥物的應用。

背景技術

過度肥胖不僅影響形體美，給生活帶來不便，而且會引起一系列的疾病，減肥是當今社會過度肥胖患者的強烈需求。當前的減肥藥物主要是一些化學合成的物質，或者從植物中提取的天然物質，效果都不是十分理想。

RNA干涉（RNA?interference）技術是近幾年發展起來的一種抑制基因表達的最有力的工具之一。此技術采用19-23個堿基或發夾狀不同長度的雙鏈RNA可使不同類型細胞的靶向基因表達明顯降低，因此，RNAi技術可使基因敲除（knock-down）或使基因沉默（gene?silencing）。這是一種典型的轉錄后基因調控方法，又稱轉錄后基因沉默(PTGS，post-transcriptional?gene?silencing)。這種新興的生物技術為疾病分子水平的治療提供了新的技術和方法，在哺乳動物細胞中建立RNA干涉技術，可以用于研究某些特定基因的功能，從而可以解決某些疾病的發病機制，同時對疾病尤其是對腫瘤的治療也有一定的應用價值，并且RNA干涉技術所使用的劑量僅為反義寡核苷酸劑量的萬分之一左右。另一方面，若小雙鏈RNA中改變1個核苷酸，就可使該RNAi靶向基因沉默作用消失，這樣，就有可能將這一技術用于抑制某些過度表達基因的表達，而不影響正常基因的表達，因此，利用RNA干擾技術制備基因藥物將是一種有效的途徑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA。

本發明的目的還在于提供一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體，以及所述載體的構建方法。

本發明的目的還在于提供一種抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA在制備減肥藥物中的應用。

本發明的目的還在于提供一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體作為減肥藥物的應用。

本發明的技術方案如下：

一種抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA，所述的siRNA為小雙鏈RNA，其正義鏈序列為序列表中SEQ?NO.1、SEQ?NO.2、SEQ?NO.3、SEQ?NO.4和SEQ?NO.5中任意一個所對應的序列。

一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體，所述載體能夠表達產生雙鏈的siRNA，并且在載體中引入了脂肪細胞特異啟動子序列；所述的siRNA為小雙鏈RNA，其正義鏈序列為序列表中SEQ?NO.1、SEQ?NO.2、SEQ?NO.3、SEQ?NO.4和SEQ?NO.5中任意一個所對應的序列；所述的脂肪細胞特異啟動子為過氧化物酶體增殖物激活受體γ2基因啟動子。

一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體的構建方法包括以下步驟

（1）脂肪細胞特異啟動子序列的克隆

根據脂肪細胞特異啟動子序列設計一對引物PP1和PP2，以人脂肪細胞提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳初步鑒定后，克隆至pMD18-T載體，并轉化感受態細胞，將篩選得到陽性菌落提取質粒，使用特異引物和/或pMD18-T載體的通用引物進行PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的重組質粒進一步測序驗證，經驗證正確的重組質粒即包含脂肪細胞特異啟動子；所述的引物序列為

PP1：5ˊ-AGGAATTCAGCGCTGCATGCTGATACCAACGT-3ˊ;

PP2：5ˊ-CGGGATCCAACAGCATGGA?ATA?GGGGTTTGC-3ˊ；

（2）pSilencer?4.1-?PPARγ2P-neo載體的構建

將驗證正確的脂肪細胞特異啟動子的PCR擴增產物雙酶切，并用同樣的酶雙酶切pSilencer?4.1-CMV-neo?載體，回收目的片段，然后將回收的啟動子序列與載體連接，并轉化感受態細胞，將篩選得到陽性菌落提取質粒，進行雙酶切驗證，酶切驗證為陽性的重組質粒進一步測序驗證，將經驗證正確的重組質粒命名為pSilencer?4.1-?PPARγ2P-neo?載體；

（3）siRNA對應的DNA序列的合成