[發明專利]一種抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA及其表達載體和應用

無效

• 申請號: 201010122228.X
• 申請日: 2010-03-11
• 公開（公告）號: CN101892226A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 井長勤;李曉娟;張秀華;高啟禹;明紅;王天云;豐慧根
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;A61K48/00;A61K31/713;A61P3/04
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 陳浩

1.一種抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA，其特征在于：所述的siRNA為小雙鏈RNA，其正義鏈序列為序列表中SEQ?NO.1、SEQ?NO.2、SEQ?NO.3、SEQ?NO.4和SEQ?NO.5中任意一個所對應的序列。

2.一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體，其特征在于：所述載體含有脂肪細胞特異啟動子序列，并且能夠產生特異性抑制人脂肪細胞ACC基因表達的小雙鏈RNA；所述的小雙鏈RNA的正義鏈序列為序列表中SEQ?NO.1、SEQ?NO.2、SEQ?NO.3、SEQ?NO.4和SEQ?NO.5中任意一個所對應的序列。

3.根據權利要求2所述的一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體，其特征在于：所述的脂肪細胞特異啟動子為過氧化物酶體增殖物激活受體γ2基因啟動子。

4.一種如權利要求2所述的能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體的構建方法，其特征在于：所述構建方法包括以下步驟

（1）?脂肪細胞特異啟動子序列的克隆

根據脂肪細胞特異啟動子序列設計一對引物PP1和PP2，以人脂肪細胞提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳初步鑒定后，克隆至pMD18-T載體，并轉化感受態細胞，將篩選得到陽性菌落提取質粒，使用特異引物和/或pMD18-T載體的通用引物進行PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的重組質粒進一步測序驗證，經驗證正確的重組質粒即包含脂肪細胞特異啟動子；

（2）pSilencer?4.1-?PPARγ2P-neo載體的構建

將驗證正確的脂肪細胞特異啟動子的PCR擴增產物雙酶切，并用同樣的酶雙酶切pSilencer?4.1-CMV-neo?載體，回收目的片段，然后將回收的啟動子序列和載體連接，并轉化感受態細胞，將篩選得到陽性菌落提取質粒，進行雙酶切驗證，酶切驗證為陽性的重組質粒進一步測序驗證，將經驗證正確的重組質粒命名為pSilencer?4.1-?PPARγ2P-neo?載體；

（3）siRNA對應的DNA序列的合成

根據序列表中任何一個siRNA的正義鏈序列，設計其對應的DNA序列，序列兩端引入酶切位點，所述DNA序列為兩條單鏈，并且兩條單鏈是一對互補序列，設計好的序列經合成后，通過退火形成雙鏈DNA，退火反應采用常規方法即可；

（4）pSilencer?4.1-?PPARγ2P-neo-DsiRNA載體的構建

將pSilencer?4.1-?PPARγ2P-neo載體進行雙酶切，所使用的兩個酶與步驟（3）中雙鏈DNA設計酶切位點時選用的酶相同，回收目的片段，然后將回收的載體與步驟（3）中形成的雙鏈DNA序列連接，并轉化感受態細胞，將篩選得到陽性菌落提取質粒，進行雙酶切驗證，?酶切驗證為陽性的重組質粒進一步測序驗證，將經驗證正確的重組質粒命名為pSilencer?4.1-?PPARγ2P-neo-DsiRNA?載體。

5.根據權利要求4所述的一種能夠產生抑制人脂肪細胞ACC基因表達的siRNA的載體的構建方法，其特征在于：所述的引物PP1和PP2的序列如下

PP1：5ˊ-AGGAATTCAGCGCTGCATGCTGATACCAACGT-3ˊ;

PP2：5ˊ-CGGGATCCAACAGCATGGA?ATA?GGGGTTTGC-3ˊ。