[發(fā)明專利]花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010121729.6
• 申請日: 2010-03-11
• 公開（公告）號: CN101836582A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設計）人: 張紹鈴;齊永杰;吳華清;吳俊;陶書田;齊開杰
• 申請（專利權）人: 南京農業(yè)大學
• 主分類號: A01H1/06
• 分類號: A01H1/06;A01H1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發(fā)明涉及花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質的方法，屬于分子遺傳學領域。

二、背景技術

梨是我國乃至世界主要水果之一，我國現(xiàn)有栽培面積108.74萬公頃(2007年中國農業(yè)年鑒的數(shù)據(jù))，是典型的配子體型自交不親和性果樹，絕大多數(shù)梨品種自花授粉不結實，生產上必須合理配置授粉樹才能保證坐果，正因為如此，梨屬植物中目前尚沒有基因純合的品種(個體)。此外，在梨屬植物中還存在品種間雜交授粉不親和的現(xiàn)象，因而田間配置授粉品種存在一定的盲目性。迄今的研究已經表明，梨自花授粉不結實以及品種間雜交授粉不結實是受S基因控制的，表現(xiàn)為當花粉的1個S基因與花柱中兩個S基因之一相同時，它們之間相互授粉就不能結實，即花粉的自花授粉不結實的表現(xiàn)型是由花粉(配子體，Gametophyte)自身的S基因型決定。因此，弄清梨花粉S基因與S基因及其產物的特異性識別功能，對于研究梨自花授粉不親和性機理具有實質性意義。但是，梨品種存在兩個不同的S基因位點，即存在兩個花粉S基因和兩個花柱S基因，這種異源二倍體基因型在研究梨花粉特異性識別功能和梨花柱S糖蛋白特異識別功能時會存在相互間的干擾，無法弄清是哪個基因的作用。創(chuàng)制梨S基因純合體種質是深入開展相關研究的前提條件，也為梨基因組學研究與特異性狀基因的分析等提供了基本保障。另外，在倍性育種方面，梨S基因純合體的創(chuàng)制也為本項工作的順利開展奠定基礎，人們可以根據(jù)自身研究的需要，自行創(chuàng)制組合所需要的S基因植株，這些材料不僅豐富了育種資源，還為以后培育出優(yōu)良的新品種創(chuàng)造了條件。總之，創(chuàng)制梨S基因純合體不僅有著良好的理論價值，而且還有著廣闊的應用前景，為完善自花授粉不結實性理論體系提供了重要的試材。

三、發(fā)明內容

技術要求

本發(fā)明的目的是：提供了一種快速創(chuàng)制梨S基因純合體新種質的方法。通過對花粉實施誘變后利用其進行自花授粉的方法，達到有效克服梨自花授粉不結實，從而獲得了自交的后代，從后代中篩選出S基因純合體的植株，并建立了快速鑒定梨S基因純合體新種質的技術體系，為梨倍性育種、花粉與雌蕊的相互識別的細胞信號轉導、S基因時空表達特性及其蛋白產物的功能驗證等方面的研究提供了很好的試材。

技術方案

花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質的方法，其特征在于：

將采集好的‘黃花’、‘豐水’梨花粉用Co⁶⁰γ射線進行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻射時間15min，各重復2次，處理當日即對去雄的‘黃花’、‘豐水’進行人工自花授粉，套上硫酸紙袋，授粉后25d調查花序坐果率，每花序留1～2個果，種子成熟后采果并取出種子，育苗；

根據(jù)梨S-RNase基因的保守序列，用Primer?premier?5.0軟件設計正反向通用引物：

PF??5′-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′

PR??5′-CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′

擴增兩自花授粉后代株系的基因組DNA，檢測梨S-RNase基因的擴增技術體系：

反應體系總體積為25μL：10×PCR?Buffer?2.5μL?3.0mM?MgCl₂，0.2mM?dNTP，各引物0.1μM，20-50ng模板，Taq酶1.0U；通用引物PCR所用程序為：94℃預變性2min，94℃15s，48℃30s，72℃3min，10個循環(huán)后，94℃變性15S，48℃退火30S，72℃3.5min，25個循環(huán)后72℃延伸7min；

在‘黃花’花粉誘變自交后代的株系中，若只能擴增出一條S₂-RNase的1347bp帶型，則說明該株系為S₂S₂的純合體，若只能擴增出一條S₁-RNase的367bp帶型，則說明該株系為S₁S₁的純合體；

在‘豐水’花粉誘變自交后代的株系中，均可擴增出一條384bp的擴增片段，用AlwNI酶切擴增產物，AlwNI酶切技術體系為：15μl反應體系中，10×Buffer?R?1.5μl，Cail?0.5μl，PCR產物7.5μl，ddH₂O5.5μl，酶切反應條件：37℃環(huán)境下反應12h～14h，若酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則對應該株系為S₅S₅的純合體；若酶切后依然是一條384bp的帶型，則說明該株系為S₃S₃的純合體，從而獲得純合的S基因種質。