[發(fā)明專利]花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質(zhì)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010121729.6
• 申請(qǐng)日: 2010-03-11
• 公開（公告）號(hào): CN101836582A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張紹鈴;齊永杰;吳華清;吳俊;陶書田;齊開杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H1/06
• 分類號(hào): A01H1/06;A01H1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質(zhì)的方法，其特征在于：

將采集好的‘黃花’、‘豐水’梨花粉用Co⁶⁰γ射線進(jìn)行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻射時(shí)間15min，各重復(fù)2次，處理當(dāng)日即對(duì)去雄的‘黃花’、‘豐水’進(jìn)行人工自花授粉，套上硫酸紙袋，授粉后25d調(diào)查花序坐果率，每花序留1～2個(gè)果，種子成熟后采果并取出種子，育苗；

根據(jù)梨S-RNase基因的保守序列，用Primer?premier?5.0軟件設(shè)計(jì)正反向通用引物：

PF?5′-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′

PR?5′-CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′

擴(kuò)增兩自花授粉后代株系的基因組DNA，檢測(cè)梨S-RNase基因的擴(kuò)增技術(shù)體系：

反應(yīng)體系總體積為25μL：10×PCR?Buffer?2.5μL?3.0mM?MgCl₂，0.2mM?dNTP，各引物0.1μM，20-50ng模板，Taq酶1.0U；通用引物PCR所用程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃15s，48℃30s，72℃3min，10個(gè)循環(huán)后，94℃變性15S，48℃退火30S，72℃3.5min，25個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min；

在‘黃花’花粉誘變自交后代的株系中，若只能擴(kuò)增出一條S₂-RNase的1347bp帶型，則說明該株系為S₂S₂的純合體，若只能擴(kuò)增出一條S₁-RNase的367bp帶型，則說明該株系為S₁S₁的純合體；

在‘豐水’花粉誘變自交后代的株系中，均可擴(kuò)增出一條384bp的擴(kuò)增片段，用AlwNI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，AlwNI酶切技術(shù)體系為：15μl反應(yīng)體系中，10×Buffer?R?1.5μl，Cail?0.5μl，PCR產(chǎn)物7.5μl，ddH₂O5.5μl，酶切反應(yīng)條件：37℃環(huán)境下反應(yīng)12h～14h；若酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則對(duì)應(yīng)該株系為S₅S₅的純合體；若酶切后依然是一條384bp的帶型，則說明該株系為S₃S₃的純合體，從而獲得純合的S基因種質(zhì)。