[發(fā)明專利]一種鑒定春蘭品種的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010120719.0
• 申請(qǐng)日: 2010-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN101818199A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李方;黃焱;夏宜平;陳昆松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬植物品種鑒定方法，涉及植物遺傳標(biāo)記和品種鑒定方法，是一種基于基因組SSR遺傳分析技術(shù)的春蘭品種分子鑒定方法。

背景技術(shù)

春蘭(Cymbidium?goeringii)屬多年生草本植物，為傳統(tǒng)國(guó)蘭之一，原產(chǎn)中國(guó)，有著悠久和栽培和選育歷史，春蘭至少包括約200個(gè)傳統(tǒng)品種。在中國(guó)它是最昂貴的盆栽花卉之一，具有極高觀賞價(jià)值和文化價(jià)值。在品種的遺傳改良過程中，正確地劃分品種群，明晰品種間的親緣關(guān)系，對(duì)親本的選擇和選配具有指導(dǎo)意義，也是育種工作成敗的關(guān)鍵之一。關(guān)于春蘭品種的傳統(tǒng)分類是以瓣型如萼片和花瓣的形態(tài)和顏色劃分為主。用傳統(tǒng)方法對(duì)品種分類鑒定具有直觀簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但這種表現(xiàn)型鑒定易受環(huán)境影響，準(zhǔn)確性不夠，性狀多態(tài)性也不夠，是遺傳標(biāo)記的初始階段，具有很大的局限性。隨著人們對(duì)品種資源遺傳特性認(rèn)識(shí)的不斷深化和分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于對(duì)物種的遺傳分析。

對(duì)春蘭品種遺傳多態(tài)性研究國(guó)內(nèi)已有報(bào)道，但品種數(shù)量較少，且多采用隨機(jī)引物，特異性相對(duì)較差。已有的研究表明，不同物種基因組DNA多態(tài)性的程度因物種及檢測(cè)方法而異。本發(fā)明基于蝴蝶蘭EST序列成功開發(fā)了春蘭的SSR標(biāo)記。春蘭基因組DNA的多態(tài)性為100％，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)為8.77條。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種鑒定春蘭品種的方法。是基于簡(jiǎn)單重復(fù)序列基因組SSR分析的春蘭品種分子鑒定方法，通過優(yōu)化春蘭簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)分析的技術(shù)體系，明晰春蘭品種的遺傳關(guān)系。本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)提取已知的現(xiàn)有112個(gè)春蘭品種基因組DNA；

(2)對(duì)所提取的春蘭品種基因組DNA分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))，得到簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)產(chǎn)物；

(3)以6％變性聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，總上樣量為5μL，其中4μL為擴(kuò)增產(chǎn)物，另加1μL?Loading?Buffer，在60W下恒功率電泳至marker跑至膠板2/3處；

(4)電泳結(jié)束后，經(jīng)Bassam銀染方法在數(shù)碼相機(jī)下照相，分別得到SSR標(biāo)準(zhǔn)圖譜；

(5)選擇清晰SSR圖譜，采用“0-1”系統(tǒng)記錄譜帶，將有帶的賦值為1，無帶的賦值為0，讀取春蘭每個(gè)品種材料在不同引物擴(kuò)增的產(chǎn)物的電泳譜帶的數(shù)據(jù)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)；

(6)基于Dice系數(shù)按非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，得到系統(tǒng)聚類樹；

(7)將所需鑒定的春蘭品種按上述步驟(1)-(5)，得到所需要鑒定春蘭品種的序列圖譜，將此序列圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較判定，得到分析鑒定結(jié)果。其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)體系如下：20μL反應(yīng)體系，正向反向引物均為10pmol(0.4μL)，Taq?DNA聚合酶0.5U(0.2μL)，dNTP?0.2mM?1.6μL，1×PCR?buffer(包括10mM?Tris-HCl(pH?8.3)50mM?KCl)(2μL)，模板DNA(50ng)1μL，超純水14.4μL。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所述的引物參見表1。

所述春蘭基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中Taq酶的用量為0.5U。

所述春蘭基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中引物的濃度為0.5μmol/L。

所述春蘭基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中引物的退火溫度見表1。

本發(fā)明能有效擴(kuò)增春蘭品種基因組DNA模版，使其擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性比率達(dá)到100％，平均每條帶出現(xiàn)的品種次數(shù)為26.96個(gè)(變幅1-108)，頻率為0.23(變幅為0.01-0.92)，其變異系數(shù)115.56％。

本發(fā)明創(chuàng)立了有效解決春蘭遺傳關(guān)系的技術(shù)方法。本發(fā)明的鑒定品種方法直接檢測(cè)品種的DNA序列差異，既具有遺傳穩(wěn)定性，又具有信息多樣性，可以明確區(qū)分和判別春蘭的不同品種，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速鑒定品種，從而為品種鑒定、種苗市場(chǎng)管理、品種保護(hù)及良種繁育等提供可靠技術(shù)。本發(fā)明優(yōu)化春蘭基因組DNA的SSR技術(shù)體系，使春蘭品種分子鑒定速度快、時(shí)間短、多態(tài)性多，能夠在交易前解決蘭苗真實(shí)性檢驗(yàn)等問題，避免造成生產(chǎn)者或購(gòu)買者的損失。本方法運(yùn)用1個(gè)及以上有效引物可以區(qū)分和鑒定所有春蘭品種，實(shí)現(xiàn)春蘭品種的DNA指紋鑒定。

附圖說明

圖1為SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(左為引物CY16，右為引物CY34)。

圖2為聚類分析得到的系統(tǒng)樹(包括112個(gè)春蘭標(biāo)準(zhǔn)品種及1個(gè)春蘭驗(yàn)證測(cè)試品種)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例一