[發明專利]一種鑒定春蘭品種的方法

無效

• 申請號: 201010120719.0
• 申請日: 2010-03-09
• 公開（公告）號: CN101818199A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 李方;黃焱;夏宜平;陳昆松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.一種鑒定春蘭品種的方法，通過以下步驟實現：

(1)提取已知112個春蘭品種基因組DNA；

(2)對所提取的春蘭品種基因組DNA分別進行聚合酶鏈式反應，得到簡單重復序列產物；

(3)以6％變性聚丙烯酰胺凝膠為介質對簡單重復序列產物進行電泳分離，總上樣量為5μL，其中4μL為擴增產物，另加1μL?Loading?Buffer，在60W下恒功率電泳至marker跑至膠板2/3處；

(4)電泳結束后，經Bassam銀染方法在數碼相機下照相，分別得到簡單重復序列標準圖譜；

(5)選擇清晰簡單重復序列圖譜，采用“0-1”系統記錄譜帶，將有帶的賦值為1，無帶的賦值為0，讀取春蘭每個品種材料在不同引物擴增的產物的電泳譜帶的數據，建立數據庫；

(6)基于Dice系數按非加權配對算術平均法進行聚類分析，得到系統聚類樹；

(7)將所需鑒定的春蘭品種按上述步驟(1)-(5)，得到所需要鑒定春蘭品種的序列圖譜，將此序列圖譜與標準圖譜進行比較判定，得到分析鑒定結果。

2.根據權利要求1所述的一種鑒定春蘭品種的方法，其特征在于，其中聚合酶鏈式反應的反應體系如下：20μL反應體系，正向反向引物均為10pmol(0.4μL)，Taq?DNA聚合酶0.5U(0.2μL)，dNTP?0.2mM?1.6μL，1×PCR?buffer2μL，模板DNA(50ng)1μL，超純水14.4μL，所述1×PCR?buffer包括pH?8.3的10mM?Tris-HCl、50mM?KCl。

3.根據權利要求1所述的一種鑒定春蘭品種的方法，其特征在于，聚合酶鏈式反應所述的引物及退火溫度為：

(1)CY2正向序列(5′→3′)CCCAAGACGCATAAAGAT

??????反向序列(5′→3′)TGCCCAGATGGTGGTAGG

退火溫度50.4℃

(2)CY8正向序列(5′→3′)TATGTGTGAGAGGGTGC

??????反向序列(5′→3′)CAATTAGTCACATCCATAAAC

退火溫度50.4℃

(3)CY11正向序列(5′→3′)GATTTATGTAGCCGACCCC

???????反向序列(5′→3′)CCTGCTCCACTCACCTGTT

退火溫度60.6℃

(4)CY13正向序列(5′→3′)AAAGTGACAGGGTAAGAGTGA

???????反向序列(5′→3′)GGCGAAGATGTTGTTGAA

退火溫度49℃

(5)CY14正向序列(5′→3′)CATGCTCACTTTTACTGCACCAC

???????反向序列(5′→3′)TCACCCTCCACCCTCGTCT

退火溫度50.5℃

(6)CY15正向序列(5′→3′)G?TAGAATGGGAGCACTTTG

???????反向序列(5′→3′)GCGTCTTTGTGGTGGACT

退火溫度50.5℃

(7)CY16正向序列(5′→3′)AGCAACGATGGAGCAAGA

???????反向序列(5′→3′)GCTGACCACGCTAACCTC

退火溫度56.3℃

(8)CY17正向序列(5′→3′)TGAATCACATCTCAAGGGTT

???????反向序列(5′→3′)AGAAGGTAGCCGAGTCATAG

退火溫度51.9℃

(9)CY24正向序列(5′→3′)GTCCCGAGCCTCACATAA

???????反向序列(5′→3′)AAAGCAGTTCCATAAAGATTG

退火溫度53.4℃

(10)CY26正向序列(5′→3′)TTATGAATCACAACCCAATG

????????反向序列(5′→3′)CTCTTCTGTTTCTATGTCCCT

退火溫度49℃

(11)CY32正向序列(5′→3′)CCCTCGTTGTAGCCTCCT

????????反向序列(5′→3′)GCTCCTCCCGATTTCTTC

退火溫度53.4℃

(12)CY33正向序列(5′→3′)GTTCACAATGCTTGGACCTC

????????反向序列(5′→3′)TTCGCTTGCTAACTACCACTAC

退火溫度49℃

(13)CY34正向序列(5→3′)ACCCACCATCCCAAAATC

????????反向序列(5′→3′)AGGGCAATCACTGTATCACTCT

退火溫度51.9℃。