[發(fā)明專利]一種以4.1R、CD29為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選模型的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010119587.X
• 申請日: 2010-03-09
• 公開（公告）號: CN101787357A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康巧珍;安秀麗;周晴晴;汲振余;閻紅霞;陳鯉翔;王婷
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種以4.1R、CD29為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選模型的制備方法，其特 征在于：包括以下步驟：

(1)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)

①取C57BL/6J_4.1R-/-小鼠胚胎，去除頭、心臟和肝臟，其余部分用 PBS洗滌3次，充分去除紅細(xì)胞后，剪成組織塊，每個胚胎加0.25％冷胰蛋白 酶，4℃過夜；

②6-12h后，吸去多余的胰蛋白酶，留下2倍于組織體積的胰蛋白酶， 37℃水浴30min，加含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，充分混勻，沉淀1min， 將上清移到一只新的無菌離心管中，而沉淀加入新的DMEM培養(yǎng)基，重復(fù)該 分離步驟；

③將上清合并，以1000rpm/min離心10min，收集細(xì)胞，用10ml DMEM培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于75cm培養(yǎng)瓶中， 于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；

④6-12h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入新的DMEM培養(yǎng)基至長成 單層，1∶5傳代；

(2)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞永生化

①含SV40大T抗原的ATCC?Number：CRL-7601的865細(xì)胞系在DMEM培養(yǎng) 基中培養(yǎng)48h后，以1000rpm/min離心10min，收集上清后，進(jìn)行濾膜過濾， 濾液按1∶5000加入聚凝胺備用；

②將5×10⁵個傳至第3代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞加入5ml上述含聚凝胺的 SV40病毒大T抗原濾液中，培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液，換成DMEM正常培養(yǎng)基進(jìn)行 傳代培養(yǎng)；

③培養(yǎng)至10代后，液氮罐中凍存。

2.一種權(quán)利要求1所述的以4.1R、CD29為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選模型的 應(yīng)用，為以蛋白4.1R和CD29為藥靶的新藥篩選制備和基因治療提供離體細(xì)胞模 型。