[發(fā)明專利]假絲酵母二羥基丙酮合成酶的原核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010117291.4
• 申請(qǐng)日: 2010-03-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101838662A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳麗梅;肖素勤;孫振;張婧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/52;C12N9/00;C07K16/40
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)假絲酵母二羥基丙酮合成酶蛋白(DAS)的原核表達(dá)載體pET28a-DAS及其在DAS蛋白的原核表達(dá)和DAS蛋白抗體制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

甲醛是一種無(wú)色，有強(qiáng)烈刺激氣味的氣體，易溶于水、醇和醚，被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，是膠粘劑工業(yè)應(yīng)用最廣泛的化學(xué)原材料。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內(nèi)公共場(chǎng)所和家庭，使甲醛成為室內(nèi)空氣污染公認(rèn)最具代表性的化學(xué)物質(zhì)。室內(nèi)空氣中游離甲醛濃度在中國(guó)規(guī)定的允許值是0.08(mg/立方米)，對(duì)新裝修住宅的調(diào)查結(jié)果表明室內(nèi)空氣中甲醛濃度是室外空氣的6.65倍，為0.492mg/m³，在門窗關(guān)閉時(shí)甲醛濃度超標(biāo)100倍。甲醛為較高毒性物質(zhì)，它反應(yīng)能力極強(qiáng)，能與蛋白質(zhì)，核酸和脂類產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)，是一種非常活潑的化合物，因此對(duì)所有的生物來(lái)說(shuō)都有很高的毒性長(zhǎng)期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻煙癌、結(jié)腸癌、腦瘤、月經(jīng)紊亂、細(xì)胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連及抑制DNA損傷的修復(fù)、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，這就是所謂的裝修綜合病(sick-house)。

相對(duì)于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游離甲苯二異氰酸酯(TDI)、揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOC)等有害物質(zhì)來(lái)說(shuō)，甲醛具有潛伏周期長(zhǎng)(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三種：一是使用環(huán)保材料；二是開(kāi)窗通風(fēng)；三是用植物或除污劑清除污染，使用除污劑有二次污染的可能。用室內(nèi)栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最環(huán)保的方式，科學(xué)研究證明確實(shí)有些植物能夠吸收分解甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese等，1994，Plant?Physiol.104：1301-1309)。

甲基營(yíng)養(yǎng)酵母具有利用一碳化合物甲醇的高效代謝機(jī)制，在甲醇的代謝途徑中，甲醇首先被乙醇氧化酶氧化為甲醛，甲醛是甲醇代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵性的中間產(chǎn)物，它處于甲醇同化和異化途徑的分支點(diǎn)上，甲醛是甲醇代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵性的中間產(chǎn)物，它處于甲醇同化和異化途徑的分支點(diǎn)上。二羥基丙酮合成酶(DAS)催化甲醛同化途徑中的第一個(gè)反應(yīng)，DAS催化酵母菌中的甲醛和木酮糖5-P形成二羥基丙酮和甘油醛3-磷酸。甲醇被乙醇氧化酶氧化成甲醛后，由它把甲醛固定到D-木酮糖5-磷酸分子上(Yurimoto等，2005，The?Chemical?Record.5：367-375)。通過(guò)突變體和酶學(xué)特性分析證實(shí)了DAS的生理作用是甲醇同化作用的關(guān)鍵酶。目前已從甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌假絲酵母(Candida?boidinii)中克隆到編碼DAS的基因(DHAS1)，進(jìn)一步的調(diào)查結(jié)果證實(shí)DAS主要參與這種酵母菌細(xì)胞中甲醛的同化作用而非異化作用或脫毒作用(Sakai等，1998，American?Society?for?Microbiology.180：5885-5890)。

二羥基丙酮對(duì)酵母細(xì)胞來(lái)說(shuō)是有毒的化合物，在酵母菌中二羥基丙酮激酶(DAK)參與二羥基丙酮的脫毒作用，它催化的反應(yīng)使二羥基丙酮磷酸化，形成無(wú)毒性的磷酸二羥丙酮，可為酵母細(xì)胞所利用。該酶普遍存在于大多數(shù)的生物體中，結(jié)合遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法，已從酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)中克隆到兩個(gè)編碼DAK的基因(YML070W/DAK1和YML053W/DAK2)，它們所編碼的蛋白質(zhì)是同型二聚體(Molin等，2003，The?journal?of?biological?chemistry.278：1415-1423)。從巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)中克隆到的DAK基因編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)中(Lüers等，Yeast.1998，Jun?15，14(8)：759-71)。