[發明專利]假絲酵母二羥基丙酮合成酶的原核表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 201010117291.4
• 申請日: 2010-03-04
• 公開（公告）號: CN101838662A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 陳麗梅;肖素勤;孫振;張婧
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/52;C12N9/00;C07K16/40
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.一種原核表達載體，在該原核表達載體中含有假絲酵母DAS基因。

2.如權利要求1所述的原核表達載體，其特征在于所述原核表達載體的起始載體為pET-28a；所述DAS基因上游添加有T7的啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操縱子序列，緊靠DAS基因的起始密碼子上游還有6個組氨酸標簽序列。

3.如權利要求1所述的原核表達載體，其特征在于上述載體中的二羥丙酮合成酶基因DAS來源于假絲酵母，在GenBank中的登錄號為：AF086822。

4.一種原核表達載體，由下述方法構建而得：

(1)從GenBank中查找假絲酵母DAS的全長基因序列，并設計序列如下的一對引物：

DAS5：5’-CATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTC-3’

DAS3：5’-CTCGAGTAAATGATTTTGATCATGTTTTGGTTTTTC-3’

5’端引物添加一個C堿基，并由此形成NcoI酶切位點；3’端引物末端加XhoI酶切位點；以假絲酵母基因組為模板通過PCR擴增，得到DAS的全長DNA序列；

(2)回收并純化DAS全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD-DAS；

(3)構建原核載體pET28a-DAS，用NcoI和XhoI雙酶切pMD-DAS和pET28a，并回收純化DAS基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行PCR擴增檢測和酶切檢測，獲得原核表達載體pET28a-DAS。

5.權利要求1-4原核表達載體的構建方法，包括下述步驟：

(1)從GenBank中查找假絲酵母DAS的全長基因序列，并設計序列如下的一對引物：

DAS5：5’-CATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTC-3’

DAS3：5’-CTCGAGTAAATGATTTTGATCATGTTTTGGTTTTTC-3’

5’端引物添加一個C堿基，并由此形成NcoI酶切位點；3’端引物末端加XhoI酶切位點；以假絲酵母基因組為模板通過PCR擴增，得到DAS的全長DNA序列；

(2)回收并純化DAS全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD-DAS；

(3)構建原核載體pET28a-DAS，用NcoI和XhoI雙酶切pMD-DAS和pET28a，并回收純化DAS基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行PCR擴增檢測和酶切檢測，獲得原核表達載體pET28a-DAS。

6.權利要求1-4的原核表達載體在制備重組DAS蛋白中的應用。

7.權利要求1-4的原核表達載體在制備DAS特異性抗體中的應用。