[發明專利]重組菌絲霉素的制備及其應用

有效

• 申請號: 201010115149.6
• 申請日: 2010-03-01
• 公開（公告）號: CN102191255A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 王建華;楊雅麟;張軍;滕達;王少然;田子罡
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/81;C12N1/19;C07K14/37;C12P21/02;A61K38/16;A61P31/04;C12R1/84
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1.重組菌絲霉素，其特征在于重組菌絲霉素基因的設計。根據菌絲霉素成熟肽氨基酸序列，按畢赤酵母偏愛密碼子，優化設計出的菌絲霉素基因具有如序列表SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

2.重組菌絲霉素，其特征在于重組菌絲霉素表達載體的構建。在如1所述的菌絲霉素基因的5′-端設計限制性內切酶Xho?I酶切位點，并保留了Xho?I酶切位點后的酵母Kex2切割位點(KR)編碼序列，以便分泌表達后信號肽的切割，在基因3′-端設計TAATAA終止子序列及XbaI酶切位點，以便多肽表達的終止及載體構建，經Xho?I和Xba?I雙酶切后克隆至經相同雙酶切后的表達載體pPICZαA上，構建重組表達載體pPICPlectasin，經測序正確。

3.重組菌絲霉素，其特征在于重組菌絲霉素酵母的構建。重組表達載體pPICPlectasin經內切酶Pme?I線性化處理，電擊轉化畢赤酵母X-33，將電擊后的混合液涂布在含100μg/ml?Zeocin的YPDS平板上，29℃培養至出現菌落，經菌落PCR鑒定陽性轉化子，甘油管保存陽性轉化子，搖瓶水平篩選高表達重組菌絲霉素畢赤酵母。

4.如權利3所述的高表達重組菌絲霉素畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母Pichia?pastoris?X33pPICPlectasin，該菌株已于2010年1月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：中國.北京.朝陽區北辰西路1號院3號)保藏，其保藏號為CGMCCNo.3564。

5.重組菌絲霉素，其特征在于重組菌絲霉素的高密度發酵表達。將篩選獲得的表達量高的重組菌絲霉素畢赤酵母菌Pichia?pastoris?X33?pPICPlectasin用5L發酵罐進行高密度發酵：挑取單菌落到YPD培養基中培養至菌體濃度OD₆₀₀在4～6之間，得到一級種子培養液；按1％接種量(V/V)轉接至YPD培養基中培養至菌體濃度OD600約3.3，得到二級種子培養液；按照10％接種量接入到2L上罐基料培養基中。菌體初生長階段轉速為900rpm，pH?5.0，溫度29℃，通氣量8L/min，生長至葡萄糖基本耗盡。進入補料生長階段：流速35％，補加50％葡萄糖(含12‰?PMT1)，轉速調至1000rpm，pH調至5.5，溫度29℃，通氣量8L/min，添加時間5h，共補加200mL。補料結束后，饑餓1h后，進入甲醇過渡誘導階段，甲醇的添加量由第一小時的1ml/h/L逐漸增加到第六小時的5.9ml/h/L，接著以恒定的流速(5.9ml/h/L)，在轉速1100rpm，pH?5.5，溫度29℃，通氣量8L/min，溶氧約40％，連續誘導120h，發酵結束上清中總蛋白濃度達到729μg/mL，收集上清透析凍干備用。

6.重組菌絲霉素，其特征在于重組菌絲霉素的純化。重組菌絲霉素的凝膠過濾層析分離步驟為：色譜柱材為葡聚糖凝膠Sephadex?G-25，純化條件：柱床體積40mL，徑高比1∶10，上樣量為1mg/mL，用去離子水進行洗脫，流速為0.5mL/min，得到的各組分進行抑菌檢測，收集抑菌活性最高組分進行凍干。將凝膠過濾層析分離所得的重組菌絲霉素凍干物溶解在超純水中(1mg/mL)，使用C18(5μm，4.6mm×250mm)色譜柱，以含0.1％TFA的乙腈水溶液為流動相，以梯度洗脫模式進行分離(8％～80％，0.8mL/min)，得到的各組分進行抑菌檢測，收集抑菌活性最高組分進行凍干，MALDI-TOF質譜儀驗證其分子量與菌絲霉素理論分子量吻合。

7.重組菌絲霉素，其特征在于重組菌絲霉素的應用。重組菌絲霉素無溶血性，具有較好的pH穩定性、熱穩定性和抗胃蛋白酶活性，可以有效的抑制革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌和的生長，因此，重組菌絲霉素在治療革蘭氏陽性菌病尤其是鏈球菌病方面具有相當大的潛力，具有潛在的抗菌藥物開發價值。