[發明專利]重組菌絲霉素的制備及其應用

有效

• 申請號: 201010115149.6
• 申請日: 2010-03-01
• 公開（公告）號: CN102191255A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 王建華;楊雅麟;張軍;滕達;王少然;田子罡
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/81;C12N1/19;C07K14/37;C12P21/02;A61K38/16;A61P31/04;C12R1/84
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種重組菌絲霉素的制備方法及其應用，具體涉及酵母基因工程菌制備重組菌絲霉素及其在治療或預防革蘭氏陽性菌尤其是鏈球菌領域的應用。

背景技術

菌絲霉素(Plectasin)是Mygind等從真菌(腐生子囊菌，the?saprophytic?ascomycetePseudoplectania?nigrella)中分離得到首例防御素(Mygind?et?al.，Nature，2005，437：975～980)。菌絲霉素基因開放閱讀框編碼一個95個殘基長的肽，由一個信號肽序列(殘基1-23)，一個前片斷(殘基23-55)和一個40個殘基的C端區域(殘基56-95)，與幾種無脊椎動物防御素存在50-55％序列相似性。與哺乳動物的α-或β-防御素沒有序列相似性。菌絲霉素，有六個半胱氨酸和五個賴氨酸，和一個區別的四肽(DEDD)模式。它的凈電荷在+1到+3之間變化，取決于它的兩個組氨酸的離子狀態。其高級結構包含一個α-β模型，由一個α-螺旋和兩個反平行的β一折疊組成，由三個二硫鍵穩定(Cys4-Cys30，Cys15-Cys37，Cys19-Cys39)。菌絲霉素高抗革蘭氏陽性菌、無細胞毒性、無溶血性及腦脊液滲透性好，在治療革蘭氏陽性菌病方面具有相當大的潛力，是具有治療潛能的新的肽抗生素。

直接從P.nigrella菌絲體中提取天然菌絲霉素時，分離提純存在一定的困難，而且產量有限?；瘜W合成和基因工程法是獲得菌絲霉素的主要手段，但化學合成菌絲霉素不僅成本高，而且空間結構難以與天然菌絲霉素完全一致，其分子內含有3對二硫鍵，難以保證多肽正確配對，限制其抗微生物活性的發揮。通過基因工程在微生物中表達抗菌肽基因是獲得菌絲霉素的有效途徑。Mygind等2005年從P.nigrella菌絲體中克隆到菌絲霉素的cDNA，將其轉化將到Aspergillus?oryzae表達系統中，分泌出具有抗菌活性的菌絲霉素(Mygind?et?al.，Nature，2005，437：975～980)。目前菌絲霉素的表達僅限于在黑曲霉中異源表達，迄今未見其在酵母中的表達研究報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組菌絲霉素的制備及應用方法，該方法利用酵母真核表達系統對菌絲霉素基因進行表達，所制備的重組菌絲霉素應用于治療或預防革蘭氏陽性菌尤其是鏈球菌領域。

本發明采用如下技術方案，其特征在于該方法，包括以下步驟：

(一)菌絲霉素基因的設計和合成

所述的菌絲霉素基因為編碼菌絲霉素成熟肽的任何核苷酸序列，優選編碼序列可根據巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)密碼子使用的偏愛性(http://www.kazusa.or.jp/codon/)優化設計，所得菌絲霉素基因具有如序列表SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，通過人工方法直接合成獲得。

(二)重組菌絲霉素表達載體的構建

所述的表達載體衍生于pPIC系列表達載體，優選的，所述的表達載體采用pPICZαA。

在菌絲霉素基因的5′-端設計限制性內切酶XhoI酶切位點，并保留了XhoI酶切位點后的酵母Kex2切割位點(KR)編碼序列，以便分泌表達后信號肽的切割獲得重組Plectasin，在基因3′-端設計TAATAA終止子序列及Xba?I酶切位點，以便多肽表達的終止及載體構建，由上海生工生物工程技術服務有限公司直接合成，菌絲霉素基因片段經Xho?I和Xba?I雙酶切后克隆至經相同酶切后的表達載體pPICZαA上，構建重組表達載體pPICPlectasin。

(三)重組菌絲霉素酵母的構建

所述的酵母優選為畢赤酵母，所述的畢赤酵母優選畢赤酵母X-33。

重組表達載體pPICPlectasin經內切酶Pme?I線性化處理，電擊轉化畢赤酵母X-33，將電擊后的混合液涂布在含100μg/ml?Zeocin的YPDS平板上，29℃培養至出現菌落，經菌落PCR鑒定陽性轉化子，甘油管保存陽性轉化子。

(四)重組菌絲霉素的表達

將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養使菌增殖至OD＝5-6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其OD值達到1.0，在29℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為0.5％，在搖瓶水平篩選表達量高的重組菌絲霉素畢赤酵母菌進行高密度發酵。