[發(fā)明專利]豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產(chǎn)量的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010115015.4
• 申請日: 2010-02-26
• 公開（公告）號: CN101775407A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發(fā)明（設計）人: 吳雙秀;黃瑞;許麗麗;王榮榮;王全喜
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N1/13;C12P3/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

技術領域

本發(fā)明涉及生物制氫技術，具體地說是一種豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產(chǎn)量的方法。

背景技術

光合生物制氫是未來清潔能源可持續(xù)生產(chǎn)的重要途徑之一，包括萊茵衣藻(Chlamydomonas?reinhardtii)在內(nèi)的許多微型綠藻和藍藻可以在缺氧的條件下誘導細胞內(nèi)的氫酶(H₂ase)基因表達，將光合作用中產(chǎn)生的H⁺和e^-合成H₂，釋放到細胞外，生物制氫是利用太陽能生產(chǎn)氫氣的理想模式。萊茵衣藻生長速度快，培養(yǎng)成本低，氫酶活性高，是很有開發(fā)潛力的微藻光合制氫藻種。但是，氫酶對氧氣極其敏感，很容易受氧氣的抑制而失去活性，而氧氣又是衣藻光合作用的主要產(chǎn)物，這一對矛盾限制了衣藻產(chǎn)氫技術的應用。為了提高衣藻光合產(chǎn)氫的效率，需要盡可能的降低衣藻細胞內(nèi)的氧氣含量或者提高氫化酶的氧耐受性。目前降低衣藻細胞內(nèi)的氧氣含量的辦法是通過抑制光合系統(tǒng)II(PS?II)活性進而抑制光解水放氧來實現(xiàn)，但是該方法同時抑制了光合鏈電子傳遞效率，影響了衣藻的產(chǎn)氫效率，另一方面，缺氧條件下衣藻的生長也受到嚴重抑制，最終也影響產(chǎn)氫效率。

豆科植物根瘤中的固氮酶與氫酶有相似的特性，也對氧氣敏感，但是根瘤中的固氮酶卻有很高的固氮活性，這與根瘤細胞中含有大量的豆血紅蛋白(leghemoglobin，簡稱Lb)有密切關系。豆血紅蛋白有兩個亞基構成，一個是球蛋白亞基，由豆科植物合成；另一個是血紅素輔基，由共生的根瘤菌合成，兩個亞基結合成為有活性的豆血紅蛋白。豆血紅蛋白具有與氧氣可逆結合、降低細胞內(nèi)氧濃度和調(diào)節(jié)呼吸作用的特性，既能維持根瘤細胞內(nèi)較低的氧氣含量，又能保障呼吸作用需氧和固氮需要的能量。中國專利200380107352.7肯和02138702.8分別公開了利用表達豆血紅蛋白改變植物貯藏儲備物含量和提高植物抗?jié)衬芰?。生物發(fā)酵工程研究中也有應用其它血紅蛋白體外重組表達而使產(chǎn)量提高的報導。

在植物細胞內(nèi)、尤其是葉綠體中，血紅素輔基前體可以通過葉綠素合成途徑合成，只是在最后一步，植物葉綠體中，原撲啉在鎂螯合酶的作用下生成葉綠素。在根瘤細胞中，原撲啉在根瘤菌合成的亞鐵螯合酶(ferrochelatase)催化下合成血紅素輔基(Sangwan和O’Brain，1991；Santana等，1998)。在植物細胞內(nèi)沒有亞鐵螯合酶基因hemH，但是在植物細胞中存在著具有與亞鐵螯合酶相似功能和相似結構的吡啶核苷酸雙硫酸氧化還原酶(pyridine-nucleotide?disulfide?oxidoreductase)蛋白酶家族，能合成與血紅素輔基有相似功能的蛋白。本發(fā)明的前期工作表明，單獨在萊茵衣藻的葉綠體中表達豆血紅蛋白的球蛋白亞基基因lba可以降低培養(yǎng)體系內(nèi)的氧氣含量和使產(chǎn)氫量提高約50％。為了進一步提高萊茵衣藻的產(chǎn)氫能力，本發(fā)明將來源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium?Japonicum)的豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和來源于大豆(Glycine?max)根瘤的豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體內(nèi)表達，解決衣藻產(chǎn)氫代謝過程中需要盡量降低細胞內(nèi)氧氣含量、保障細胞內(nèi)低氧環(huán)境又要盡量保證其正常代謝的難題。本發(fā)明人曾發(fā)明大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產(chǎn)量的方法(中國專利201010107922.4)，為了更進一步提高萊茵衣藻生物制氫產(chǎn)量，本發(fā)明將來源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium?Japonicum)的豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因和來源于大豆(Glycine?max)根瘤的豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體內(nèi)表達，萊茵衣藻制氫產(chǎn)量得到顯著提高，取得了出人意料之外的效果。本發(fā)明首次利用豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體內(nèi)具有新穎性和創(chuàng)造性；本發(fā)明解決了衣藻產(chǎn)氫代謝過程中保證其正常代謝的技術難題，具有實用性。隨著生物制氫技術的發(fā)展，本發(fā)明將愈發(fā)顯現(xiàn)出越來越大的實用性和重要性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因，更好的提高萊茵衣藻和各種微藻制氫產(chǎn)量的技術方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產(chǎn)量的方法，步驟如下：

(1)萊茵衣藻和慢生大豆根瘤菌培養(yǎng)：

A、選細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；

B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種：