[發明專利]豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產量的方法

無效

• 申請號: 201010115015.4
• 申請日: 2010-02-26
• 公開（公告）號: CN101775407A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 吳雙秀;黃瑞;許麗麗;王榮榮;王全喜
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N1/13;C12P3/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

1.豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產量的方法，步驟如下：

(1)萊茵衣藻和慢生大豆根瘤菌培養：

A、選細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；

B、培養萊茵衣藻藻種：

(a)萊茵衣藻正常培養條件：溫度25±1℃；日光燈光照強度100～200微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons?m^-2s^-1)；50～100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡稱TAP)培養基液體培養，初始pH7.2，水平搖床轉速100～130rpm，每5～6天1％接種繼代培養；

(b)固體平板TAP培養基：瓊脂粉1.5％；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；

C、萊茵衣藻產氫培養條件：在缺硫培養基中進行，把正常的TAP培養基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對數期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細胞并用缺硫培養基洗3次，懸浮在缺硫培養基內，分別裝在培養瓶內，培養瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養24小時，然后放在連續光照件下培養，光照強度50～100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons?m^-2s^-1)，溫度25±1℃；每24小時進行氣體成分和含量檢測一次；

D、慢生大豆根瘤菌培養條件：用pH?7.2的酵母提取液-甘露醇液體培養基，溫度28±1℃、黑暗條件下200rpm轉速震蕩培養，至對數生長期，吸光度OD₆₀₀值達到0.6-0.8，1％接種繼代；

E、用氣相色譜儀測定氫氣和氧氣含量：分子篩5×1/8(OD)，柱長2m，內徑3mm，熱導檢測器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50℃，進樣溫度200℃，熱導檢測溫度300℃；

(2)豆血紅蛋白hemH基因和lba基因的克隆：

A、取序列號M92427慢生大豆根瘤菌hemH基因和序列號V00453大豆lba基因；

B、分別提取慢生大豆根瘤菌的總DNA，提取大豆的總RNA，再對大豆總RNA進行濃度和純度檢測，反轉錄成cDNA；

C、分別克隆hemH基因和lba基因；反應條件為：94℃預變性5min，一個循環；94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸1.5min；共30個循環；72℃延伸15min；反應產物純化回收；

C、測序鑒定hemH基因、lba基因的特異性引物：

hemH基因的特異性引物為：

hemH-P1：5’-atgtcgaccgccgctc-3’，斜體表示SacII酶切位點序列，方框中的序列是加入的增強翻譯能力的RBS序列；

hemH-P2：5’-tatatccagccctggagctcgcg-3’，斜體表示SacII酶切位點序列；

lba基因的特異性引物為：

Lba-P1：5’-c?aaa?ttt?aaa?ttt?atg?gtt?gct?ttc?actgag-3’，斜體表示SmalI酶切位點序列，方框中的序列是加入的增強翻譯能力的RBS序列；

Lba-P2：5’-tcc??ata?cta?att?atg?cct?tct?taa?tag?c-3’，斜體表示SacI酶切位點序列；

(3)萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建：

A、用限制性內切酶SmalI和SacI酶切克隆得到的大豆lba基因片段和載體cg40，將純化的lba基因片段通過上述酶切位點用T4?DNA連接酶連接質粒cg40中的aadA基因，形成aadA-lba融合基因，得到載體cg401-1-lba；用SacII酶切位點將hemH基因用T4DNA連接酶連入到質粒cg401-1-lba中aadA基因之后和lba基因之前，形成aadA-hemH-lba融合蛋白，構建得到衣藻葉綠體表達載體cg401-1-hemH-lba；轉化大腸桿菌DH5α，用于保存、鑒定和大量制備質粒DNA；

(4)萊茵衣藻葉綠體的轉化：

A、取100ml對數期中后期的萊茵衣藻，25℃下3000rpm離心5min收集藻細胞，用新鮮TAP洗三次，涂于新鮮TAP固體平板上；光照100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons·m^-2·s^-1)和25±1℃條件下培養24小時；用基因搶轟擊轉化；真空度9.48192×10⁴Pa，轟擊距離9cm，氦氣壓力7.584236×10⁶Pa，金粉子彈經限制性內切酶EcoRI酶切質粒cg401-1-hemH-lba?DNA包裹，金粉子彈顆粒直徑1.0微米；

B、轉化后的衣藻在光照和25±1℃條件下，過渡培養18h，用TAP液體培養基沖洗，涂布于含壯觀霉素100μg/ml的TAP固體選擇培養基上，在25±1℃和100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons·m^-2·s^-1)的連續光照條件下，培養約7～15天；取有抗性的單藻落分別在選擇培養基上多次繼代培養；分別進行產氫培養，并檢測產氫量和耗氧量；

(5)分析轉基因萊茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表達：

A、hemH-lba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測：

a、hemH基因和lba基因通過同源重組交換整合到萊茵衣藻葉綠體DNA上，以轉基因衣藻總DNA為模板的PCR產物為8229bp；未整合的PCR產物是5400bp；與萊茵衣藻葉綠體DNA結合的引物是cpDNA-P1：5’-aga?cag?cca?aca?ttt?tgtta-3’；cpDNA-P2：5’-gct?tca?aaa?aca?aaa?tca?aa-3’；

b、取對數生長后期的衣藻培養液，4℃低速離心收集，加350μl?NET重懸沉淀；加入25μl?10mg/ml的蛋白酶K及25μl?20％SDS，混勻37℃水浴12小時，冰上冷卻；加入200μl?5mol/L?KAc，靜置離心；上清中加入等體積25∶24∶1的酚/氯仿/異戊醇溶液抽提2次，再用等體積的氯仿抽提1次，總DNA用無水乙醇沉淀和70％乙醇洗滌，干燥后溶于30μl?TE緩沖液，用于PCR檢測；

B、轉基因萊茵衣藻中hemH基因和lba基因轉錄的檢測：

取對數生長期中期的萊茵衣藻，室溫3000rpm離心5分鐘收集藻細胞，提取總RNA，反轉錄cDNA；利用hemH基因和lba基因的特異性引物和克隆hemH基因和lba基因所述的PCR條件擴增，進行hemH基因和lba基因轉錄水平的檢測；

C、轉基因萊茵衣藻中亞鐵螯合酶和Lba表達量的檢測：

a、按下列配比制備蛋白提取緩沖液：50mM?Tris/HCl?pH?8.3plus?1％Triton-X?100；上樣緩沖液：0.25M?Tris-HCl，pH?8.0；25％?glycerol；7.5％SDS；0.25mg?ml-1?bromophenolblue；12.5％(v/v)2-mercaptoethanol；

b、取產氫培養的萊茵衣藻培養液，快速室溫3000rpm離心5min收集藻細胞，用250μl蛋白提取緩沖液懸浮，加入2μl?β-巰基乙醇，液氮凍融三次；4℃條件下離心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上樣緩沖液，用10％的分離膠和5％的濃縮膠進行凝膠電泳，轉PVDF膜；分別用抗豆血紅蛋白亞鐵螯合酶多克隆抗體和抗大豆Lba多克隆抗體做性免疫雜交檢測，對HRP標記的抗體進行化學發光檢測；

(6)分析重組豆血紅蛋白hemH-lba基因對萊茵衣藻生長的影響：

A、用TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計檢測萊茵衣藻在750nm處的吸光度；

B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細胞，加入同體積的95％乙醇溶液，混合均勻，室溫避光放置20min，4℃下12000rpm離心10min；取上清，測定OD₆₆₅及OD₆₄₉的吸光值；

C、計算總葉綠素的含量，單位mg/L：葉綠素Chl(mg/l)＝20.04×OD₆₄₉+6.10×OD₆₆₅；

(7)分析豆血紅蛋白hemH-lba基因對萊茵衣藻產氫培養的耗氧量和產氫量的影響：

A、缺硫培養基中耗氧量和產氫量的檢測：

B、含硫培養基中耗氧量和產氫量的檢測。