[發(fā)明專利]一種微量核酸檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010114725.5
• 申請(qǐng)日: 2010-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN102010893A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬俊松;周志圖;胡勝標(biāo)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 萬俊松
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)方法，具體是一種微量核酸檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

近年來，DNA分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法學(xué)、環(huán)境等諸多領(lǐng)域，成為科學(xué)研究的一大重點(diǎn)。然而，用于分析的樣本DNA含量可能極其有限，少有遺損就可能導(dǎo)致無法成功檢測(cè)或者沒有足夠的樣本DNA來滿足再次檢測(cè)的需要。因此如何對(duì)獲得的極其微量的DNA樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，成為目前相關(guān)學(xué)科關(guān)注的熱點(diǎn)之一。因此開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)手段顯得十分重要與迫切。石英晶體微天平可以適時(shí)檢測(cè)DNA，操作較為簡(jiǎn)便快捷，但是缺點(diǎn)是檢測(cè)精度不高，無法達(dá)到臨床檢測(cè)的要求，從而限制了它的推廣。如(1)Patolsky，F(xiàn).；Lichtenstein，A.；Willner，I.J.Am.Chem.Soc.2001，123，5194-5205；(2)Patolsky，F(xiàn).；Lichtenstein，A.；Willner，I.J.Am.Chem.Soc.2000，122，418-419；(3)Bardea?A；Dagan?A；Ben-Dov?I.A.Bardea，A.Dagan，I.Ben-Dov，B.Amitand?I.Willner，Chem.Commun.(1998)，839-840，。?

國(guó)內(nèi)學(xué)者利用多重置換擴(kuò)增技術(shù)用于法醫(yī)學(xué)微量DNA檢測(cè)，陳玲，劉超，王慧君，邱平明.Evidence?Science，2008Vol.16，No.6，754-756。但是這種方法操作較為繁瑣，同時(shí)需要知道原始DNA樣本的濃度，因此該方法在實(shí)際使用中受到了很大限制。還有人學(xué)者，對(duì)微量DNA檢測(cè)也是采用PCR方法，但是他們采用乙醇沉淀法回收PCR中的模版從而較少了微量DNA樣本的損失，?該操作的缺點(diǎn)一是操作較為繁瑣費(fèi)時(shí)，另外在PCR過程和乙醇沉淀過程中模版DNA都會(huì)有損失，因此實(shí)際應(yīng)用仍然受限。?

基于上述不足，本發(fā)明研究了新的微量核酸定量檢測(cè)方法，研究基于UltraPowerDNA核酸染料與核酸結(jié)合熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800-1000倍的原理，可以方便的進(jìn)行微量DNA的檢測(cè)，而且檢測(cè)的DNA分子量范圍寬，更具實(shí)用性。同時(shí)引入了計(jì)算機(jī)程序分析手段，不僅提高了分辨率同時(shí)降低了誤差，最低可檢出12.5pg/μL核酸。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在提供一種微量核酸檢測(cè)方法，以解決背景技術(shù)中的不足。?

一種微量核酸檢測(cè)方法，利用UltraPowerDNA核酸染料與核酸結(jié)合熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800-1000倍的原理，采用了計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行分析最低可檢出12.5pg/μL核酸，該方法的具體步驟為：?

(1)儀器安裝：?

首先將UltraPower可見光凝膠透射儀置于水平桌面；使用時(shí)，直接把變壓器電源插頭接變壓器插口，安裝完畢待用；?

(2)試驗(yàn)操作：?

將待測(cè)樣品準(zhǔn)備好，同時(shí)準(zhǔn)備已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA，染料為自主研發(fā)的UltraPower核酸染料(即用型)，具體操作步驟：?

A標(biāo)準(zhǔn)品的處理：標(biāo)準(zhǔn)品的濃度并不十分固定，可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，一般核酸的終濃度在10-2000pg/μL的條件下，可以得到比較好的線性關(guān)系。?因此可將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至濃度為：1600，800，400，200，100，50，25pg/μL，同時(shí)以用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品核酸的蒸餾水做空白對(duì)照；?

B在透明管內(nèi)進(jìn)行操作，如可以使用PCR管或八連管等。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與UltraPower核酸染料(即用型)等體積混勻(如5μL核酸溶液與5μL?UltraPower^TM核酸染料(即用型)混勻)此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品核酸的終濃度為800，400，200，100，50，25，12.5，0pg/μL，在室溫下避光放置30min，使UltraPower^TM核酸染料與待測(cè)DNA充分反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管放在透射儀的藍(lán)色顯色板上，將暗箱蓋好；?

(3)DNA成像：?

打開UltraPower可見光凝膠透射儀的電源，由于UltraPower核酸染料與待測(cè)DNA反應(yīng)后會(huì)發(fā)出熒光，通過暗箱上方的顯色片就可以清楚的觀測(cè)到發(fā)光的DNA樣品，用數(shù)碼相機(jī)拍照；?

(4)DNA樣品濃度分析?

拍照后，打開計(jì)算機(jī)，進(jìn)入pgdetect程序，將上步中拍好的圖片導(dǎo)入pgdetect程序，點(diǎn)擊檢測(cè)按鈕進(jìn)行DNA濃度分析；?

pgdetect程序界面主要有以下幾個(gè)部分組成：?