[發明專利]肺癌組織蛋白印跡膜片及其制備方法

無效

• 申請號: 201010114561.6
• 申請日: 2010-02-10
• 公開（公告）號: CN101782585A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發明（設計）人: 何建行;盧文菊;張奇;王健
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院;呼吸疾病國家重點實驗室
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574;G01N21/31;G01N1/28;B01D57/02
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 張文雄

技術領域

本發明涉及一種肺癌組織蛋白印跡膜片及其制備方法，屬醫療研究領域。

背景技術

肺癌又稱支氣管肺癌，是起源于支氣管和肺泡上皮細胞的惡性腫瘤，肺癌們已成為目前發病率和死亡率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌5年生存率僅有10％～15％，晚期肺癌的治療更是難點。肺癌中80％是非小細胞肺癌，并且以鱗癌、腺癌和大細胞癌為主，多數發現時已經是中晚期，手術、放化療等綜合治療效果不理想。另外，20％的肺癌是小細胞肺癌，其總體預后更差。因此，對于肺癌的研究十分迫切。隨著分子生物學技術的迅速發展，對肺癌的研究已經深入到基因、蛋白等分子水平，其發病機制也被逐漸認識并推向運用。蛋白質印跡(western?blotting)，它是根據抗原抗體的特異性結合特性檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。其具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。蛋白質印跡技術廣泛應用于人類醫學研究，肺癌作為高發腫瘤，對其相關蛋白的研究是目前肺癌研究領域中不可缺少的組成部分?，F有技術中，檢測已知肺癌蛋白質表達的免疫印跡研究，一般經過臨床標本收集，蛋白質的抽提與定量，SDS-PAGE的凝膠電泳，轉膜印跡，封閉，免疫反應和成像等過程，存在操作流程繁瑣，耗時較長，組織樣本來源受到限制等缺點。

發明內容

本發明的第一個目的，是為了解決現有技術的不足，提供一種保存與運輸方便快捷、可操作性強，并且重復性好的肺癌組織蛋白印跡膜片。

本發明的第二個目的，是為了提供一種肺癌組織蛋白印跡膜片的制備方法。

本發明的第一個目的可以通過以下技術方案達到：

一種肺癌組織蛋白印跡膜片，其結構特點是：包括活化聚偏二氟乙烯膜PVDF，在所述活化聚偏二氟乙烯膜PVDF上形成瞬時受體電位通道TRPC6，其分子量位于非預染蛋白分子量標準品120kda與85kda之間，最佳分子量為96kda；或者在所述活化聚偏二氟乙烯膜PVDF上形成細胞骨架蛋白(Beta-Action)免疫印跡，其細胞骨架蛋白(Beta-Actin)的位于非預染蛋白分子量標準品40kda之上，最佳分子量為43kda。

本發明的第二個目的可以通過以下技術方案達到：

一種肺癌組織蛋白印跡膜片的制備方法，其特點在于通過肺癌組織蛋白的抽提、電泳分離及轉膜制備而成，具體包括以下步驟：

(一)蛋白的抽提

首先，切取適量的肺癌組織，用預冷的磷酸鹽緩沖液漂洗去除血跡和炭塵，濾紙吸干并剪碎放入1～2ml的玻璃勻漿器中，在勻漿器中加入冰浴預冷的放射免疫沉淀分析裂解液體以及4μl蛋白酶抑制劑-苯甲基磺酰氟，冰上間斷勻漿，然后，急速凍融勻漿組織3次，使勻漿產物充分裂解，將裂解產物完全轉移至1.5ml離心管中，在4℃下以10000g離心50min，取上清分裝于0.2ml離心管中，部分置于-80℃保存，部分用于蛋白濃度測定；

(二)蛋白濃度測定

取8ml染料，加入32ml超純水，混勻后濾紙過濾后置于冰上備用，其中標準品的制備是加入牛血清白蛋白和上述的蛋白量，而樣品的制備則是加入母液，將標準品及樣品各取300μl加入96孔平底板，常溫孵育10min后在595nm波長下測定吸光度；

(三)蛋白樣品預處理

抽提蛋白樣品與2X上樣緩沖液按1∶1體積比混合，沸水煮3min后，立即置冰浴3min，使溫度降至室溫左右，然后輕度離心，渦旋勻，再離心，準備上樣；

(四)電泳分離

首先配制分離膠和濃縮膠，其中分離膠的配制成分是：超純水3.8ml，30％丙稀酰胺/甲叉雙丙稀酰胺4.62ml，1.5mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽2.88ml，10％十二烷基硫酸鈉110μl，，10％過硫酸胺110μl，，四甲基二乙胺4.62μl，而濃縮膠的配制成分是：超純水3.0ml，30％丙稀酰胺/甲叉雙丙稀酰胺0.8ml，0.5mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽1.26ml，，10％十二烷基硫酸鈉50μl，，10％過硫酸胺30μl，四甲基二乙胺3.0μl，將膠置于模具內，加入新鮮電泳緩沖液，測無漏后補齊電泳緩沖液，然后在凝膠兩側的上樣孔加入3.5μl和7μl的預染蛋白質分子量標準品，以100V電泳10min，再以150V電泳直至溴酚藍染料跑至膠底；

(五)轉膜