[發明專利]肺癌組織蛋白印跡膜片及其制備方法

無效

• 申請號: 201010114561.6
• 申請日: 2010-02-10
• 公開（公告）號: CN101782585A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發明（設計）人: 何建行;盧文菊;張奇;王健
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院;呼吸疾病國家重點實驗室
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574;G01N21/31;G01N1/28;B01D57/02
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 張文雄

1.一肺癌組織蛋白印跡膜片，其特征在于：包括活化聚偏二氟乙烯膜PVDF，在所述活化聚偏二氟乙烯膜PVDF上形成瞬時受體電位通道TRPC6，其分子量位于非預染蛋白分子量標準品120kda與85kda之間；或者在所述活化聚偏二氟乙烯膜PVDF上形成細胞骨架蛋白免疫印跡，其細胞骨架蛋白的位于非預染蛋白分子量標準品40kda之上。

2.一種肺癌組織蛋白印跡膜片的制備方法，其特征在于通過肺癌組織蛋白質的抽提、電泳分離及轉膜制備而成，具體包括以下步驟：

(一)蛋白的抽提

首先，切取適量的肺癌組織，用預冷的磷酸鹽緩沖液漂洗去除血跡和炭塵，濾紙吸干并剪碎放入1～2ml的玻璃勻漿器中，在勻漿器中加入冰浴預冷的放射免疫沉淀分析裂解液體以及4μl蛋白酶抑制劑-苯甲基磺酰氟，冰上間斷勻漿，然后，急速凍融勻漿組織3次，使勻漿產物充分裂解，將裂解產物完全轉移至1.5ml離心管中，在4℃下以10000g離心50min，取上清分裝于0.2ml離心管中，部分置于-80℃保存，部分用于蛋白濃度測定；

(二)蛋白濃度測定

取8ml染料，加入32ml超純水，混勻后濾紙過濾后置于冰上備用，其中標準品的制備是加入牛血清白蛋白和上述的蛋白量，而樣品的制備則是加入母液，將標準品及樣品各取300l加入96孔平底板，常溫孵育10min后在595nm波長下測定吸光度；

(三)蛋白樣品預處理

抽提蛋白樣品與2X上樣緩沖液按1∶1體積比混合，沸水煮3min后，立即置冰浴3min，使溫度降至室溫左右，然后輕度離心，渦旋勻，再離心，準備上樣；

(四)電泳分離

首先配制分離膠和濃縮膠，其中分離膠的配制成分是：超純水3.8ml，30％丙稀酰胺/甲叉雙丙稀酰胺4.62ml，1.5mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽2.88ml，10％十二烷基硫酸鈉110μl，，10％過硫酸胺110μl，，四甲基二乙胺4.62μl，而濃縮膠的配制成分是：超純水3.0ml，30％丙稀酰胺/甲叉雙丙稀酰胺0.8ml，0.5mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽1.26ml，，10％十二烷基硫酸鈉50μl，，10％過硫酸胺30μl，四甲基二乙胺3.0μl，將膠置于模具內，加入新鮮電泳緩沖液，測無漏后補齊電泳緩沖液，然后在凝膠兩側的上樣孔加入3.5l和7l的預染蛋白分子量標準品，以100V電泳10min，再以150V電泳直至溴酚藍染料跑至膠底；

(5)轉膜

輕輕揭開玻璃板，刮除濃縮膠，取出分離膠，放電轉液浸泡10min，再按膠大小剪切好聚偏二氟乙烯膜和濾紙，其中聚偏二氟乙烯膜預先用甲醇浸泡活化，活化后的聚偏二氟乙烯膜同濾紙一起放置轉移緩沖液中浸泡10min，然后制作三明治，膜正膠負，即負極-夾子-海綿墊-濾紙-凝膠-聚偏二氟乙烯膜-濾紙-海綿墊-夾子-正極，將三明治放入轉移槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面，補齊電轉液，以恒壓100V進行2h，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，即可制得肺癌組織蛋白印跡膜片。

3.如權利要求2所述的一種肺癌組織蛋白印跡膜片的制備方法，其特征在于采取如下方法封閉保存：將上述的肺癌組織蛋白印跡膜片用封閉液(5％脫脂牛奶-TBST)于室溫孵育1h，然后棄去封閉液，將肺癌組織蛋白印跡膜片密封裝于塑料雜交袋中，加入適量的儲存液(0.02％疊氮鈉-TBST)，在4℃下儲存。