[發明專利]一種香蕉穿孔線蟲早期分子檢測方法

無效

• 申請號: 201010113930.X
• 申請日: 2010-02-25
• 公開（公告）號: CN101792755A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 彭德良;王瓊;耿麗鳳;李佳;彭煥;張東升
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明涉及植物病害的分子生物學檢測技術，特別涉及一種香蕉穿孔線蟲DNA提取液、 提取方法及早期分子檢測方法

背景技術

香蕉穿孔線蟲(Radopholus?similis)，英文俗名the?burrowing?nematode；Blackhead?or toppling?disease?of?bananas)，又叫相似穿孔線蟲，它是一種極具毀滅性的外來入侵植物檢疫性 有害線蟲，也是我國對外植物檢疫對象^[58]。香蕉穿孔線蟲(Radopholus?similis)為遷移性內 寄生線蟲，在全世界范圍內的熱帶及亞熱帶均有分布^[5]。它的寄主范圍也非常廣泛，已報道 的寄主多達360多種，其中大多數屬偶然寄主(在罹病香蕉樹附近存在)和人工接種寄主。

近年來，隨著我國加入WTO，農產品國際貿易往來迅速發展、人員交流的日益頻繁和旅 游業的發展，從香蕉穿孔線蟲疫區國家或地區引進各種花卉苗木及種質材料的種類和數量迅 速增加，由寄主植物攜帶而將該線蟲傳入中國的可能性和傳入風險日益劇增。近年來不斷由 我國各口岸截獲香蕉穿孔線蟲，事實上香蕉穿孔線蟲已經逼近國門，入侵后將對我國農業生 產帶來毀滅性的打擊和極度嚴重的損失。由于香蕉穿孔線蟲寄主范圍廣，這些寄主植物在中 國廣泛分布。所以，如果香蕉穿孔線蟲一旦從中國的溫室中擴散到大田，則極易定殖和流行。 這將給中國的農業生產造成嚴重危害。

在香蕉穿孔線蟲的鑒定與檢測方面，往往主要以形態鑒定為主，但因為形態特征變化幅 度較大及表型特征不穩定問題，傳統形態鑒定往往比較困難，導致誤診。并且傳統的形態堅 定耗時、費力，往往需要專業人士操作，并且需要大量線蟲樣本，在單頭線蟲水平上不能達 到要求。而在PCR技術上建立起來的分子鑒定方法的一系列研究進展克服了傳統鑒定方法上 的缺陷。目前已有許多有關利用分子和生化方法鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，如RFLP、同工酶、 RAPD、PCR等主要進行系統進化分析，揭示種間、種內差異。在植物檢疫領域中，DNA 分子標記是目前線蟲學研究中發展較快的一種鑒定手段。線蟲種特異性引物PCR擴增檢測或 雙重PCR擴增檢測是近年重要植物線蟲分子診斷的重要進展之一。通過一次PCR測驗就可 以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種。

基于核糖體DNA(rDNA)而構建的線蟲特異性引物進展較快，在診斷根腐線蟲、根結 線蟲中取得了突破性進展，形成了特異性診斷4種重要根腐線蟲如穿刺根腐線蟲P. penetrans、斯克里布根腐線蟲P.scribneri、咖啡根腐線蟲P.Coffeae和盧賽根腐線蟲P.loosi 的特異性引物，以及3種根結線蟲如戚烏得根結線蟲M.Chitwoodi、法拉克斯根結線蟲M.fallax 和北方根結線蟲M.Hapla(Zijlstra，C.1997，Petersen?et?al.，1997，Williamson?et?al.，1997)的特 異性引物，診斷的水平達到單條幼蟲的水平。

Mulholland?et?al.(1996)分別構建了馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的特異性引物，描述了一 種基于rDNA-ITS區域特異性等位多重PCR技術檢測這兩種線蟲的方法，能快速鑒定馬鈴薯 白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其復合種群。與標準的PCR途徑不同，這一技術在每個PCR反應 中應用了3個引物，通用引物5.8SrRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物ITS1-Gr和馬鈴薯白線 蟲的特異性引物ITS1-Gp。Bulman?&?Marshall(1997)成功應用多重PCR技術快速診斷馬 鈴薯孢囊線蟲。在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的rDNA-ITS的序 列結構基礎上，構建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSr3和白線蟲的特異性引物PITSp4， 通用引物ITS5與PITSr3可以擴增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，與PITSp4可以擴增出 265bp特異性識別馬鈴薯白線蟲的DNA片段。在一個PCR反應中，使用PITSr3，PITSp4和 ITS5這3個引物，即使復合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從復合 種群檢測出金線蟲。