[發(fā)明專利]酶解白果蛋白制備多肽類活性物質(zhì)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010112096.2
• 申請日: 2010-02-12
• 公開（公告）號: CN102086465A
• 公開（公告）日: 2011-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王成章;陳西娟;葉建中;陳虹霞;馬維新;周彬;程耀波
• 申請（專利權(quán)）人: 中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;邳州鑫源生物制品有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張惠忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物活性物提取分離技術(shù)，尤其涉及一種酶解白果蛋白制備多肽類活性物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

近年，多肽蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展迅速，尤其是具有生理和藥物活性的天然多肽和蛋白質(zhì)，目前已有為數(shù)不少的新成分被發(fā)現(xiàn)，它們不僅在調(diào)節(jié)機體功能上發(fā)揮重要的作用，而且在抗愛滋病、癌癥、心腦血管等疾病上也具有活性。銀杏白果不僅含有黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、微量元素，油脂。而且含有10％以上的蛋白質(zhì)。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)白果中有動力精樣物質(zhì)核糖核酸酶，鄧乾春等人從銀杏白果中分離白果活性蛋白((Ginkgo?Albumin?Protein，GAP)。GAP是以清蛋白為主且具有顯著生物活性的蛋白；謝筆鈞研究了白果活性蛋白的酶法水解及抗氧化活性、抑制腫瘤活性及其免疫功能調(diào)節(jié)作用。研究表明白果肽段較酶解前的活性蛋白，其抗氧化活性有不同程度的提高，然而目前國內(nèi)外的相關(guān)研究還極不深入，尤其是活性蛋白的高效提取分離及其生物轉(zhuǎn)化活性多肽的加工技術(shù)。

植物蛋白質(zhì)占世界蛋白供應(yīng)總量的70％以上，其營養(yǎng)價值與動物蛋白質(zhì)接近，且膽固醇含量低，含有大量人體必需氨基酸，是人類食用蛋白質(zhì)重要來源。但蛋白質(zhì)以大分子的形式存在，其氨基酸單體的數(shù)量大于100，其中不含各種分子量較少的小肽，因此不利于人體吸收。植物蛋白資源擴大應(yīng)用的出路在于利用生物方法或酸堿化學(xué)方法對植物蛋白進(jìn)行加工處理，以降低其分子量，同時去除抗?fàn)I養(yǎng)因子及毒素，改善營養(yǎng)價值與功能特性，提高溶解性能，使其生物效價接近動物蛋白質(zhì)，代替部分動物蛋白質(zhì)，達(dá)到充分利用植物蛋白資源的目的。

蛋白質(zhì)水解可轉(zhuǎn)化為多肽，目前主要采用酸法水解和酶法水解。酸法因水解程度不易控制、生產(chǎn)條件苛刻、氨基酸受到損害而很少采用；酶法水解不損害氨基酸而大多被采用，但酶的選擇至關(guān)重要。因此，利用生物酶法降解活性蛋白，制備活性多肽及氨基酸等生物活性物質(zhì)，食入人體后，具有降低膽固醇作用，亦有利于腸道內(nèi)的乳酸菌、雙岐菌的生長，具有很高營養(yǎng)價值與功能特性，該法被廣泛運用且成為研究熱點，尤其是多肽、蛋白類藥物脂質(zhì)體產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅速，如Berna?Biotech公司采用Virosome技術(shù)，在脂質(zhì)體的磷脂雙分子層上嵌入病毒膜蛋白，制備脂質(zhì)體疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種高轉(zhuǎn)化率的酶解白果蛋白制備多肽類活性物質(zhì)的方法法，所得到的多肽純度高。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種酶解白果蛋白制備多肽類活性物質(zhì)的方法，由以下步驟組成：

第一步，制備脫脂白果粉：將新鮮白果去殼，除衣皮，用打漿機在低于20℃的溫度下打漿成膏狀，然后用非極性溶劑或超臨界CO₂萃取油脂，再在-10℃--50℃冷凍干燥，得到水分的重量百分含量小于5％、破碎，過篩，得到粒度為100～200目的脫脂白果粉；

第二步，酶水解脫脂白果粉：將所述脫脂白果粉和去離子水按質(zhì)量比為1∶5～1∶15混合，再向其中添加酶，酶的添加質(zhì)量為所述脫脂白果粉的5％～20％，加熱使混合物溫度處于30～60℃下，調(diào)節(jié)使其pH值處于7～10，攪拌反應(yīng)3～48h，水解后離心分離，收集上清液；

第三步膜分離酶解液，截留分子量為3000-10000道爾頓多肽類活性物，在低于30℃下真空濃縮得到濃縮酶解液；

第四步多肽的純化：將質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為50～90％的乙醇或丙酮溶液與所述濃縮酶解液按體積比1-10∶1混合攪拌，沉淀多糖類物質(zhì)，離心過濾制得清液，再加入試劑，所述試劑為三氯乙酸、丙酮、(NH₄)₂SO₄中的任何一種或其混合物，所述試劑與所述清液體積比1-10∶1，并混合攪拌，沉淀得到多肽類活性物；

第五步白果多肽粉的制備∶將第四步得到的所述多肽類活性物，依次用丙酮、乙醇、甲醇洗滌得到沉淀，沉淀在-10℃--50℃冷凍干燥，得到白果多肽粉。

上述技術(shù)方案中，多肽類活性物分子量為3000-10000道爾頓，多肽的質(zhì)量百分含量為50～80％，所含水分的質(zhì)量百分含量低于5％，粒度100～200目；其中多肽中賴氨酸含量大于7％，組氨酸大于8％，絲氨酸大于11％，天冬氨酸大于14％，谷氨酸大于16％。

酶為活性大于80萬u/g的木瓜蛋白酶，活性大于20萬u/g的枯草桿菌堿性蛋白酶，活性大于15萬u/g的中性蛋白酶、活性大于100萬u/g的纖維素酶、活性大于80萬u/g的果膠酶中的一種或一種以上的混合物。