[發(fā)明專利]通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010110946.5
• 申請日: 2010-02-21
• 公開（公告）號: CN101831454A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳麗梅;肖素勤;王莎莎;梁峰;李莉;孫振;嚴(yán)金平;李昆志
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/82
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種通路克隆(Gateway)技術(shù)的入門載體，特別是含有通路克隆技術(shù)LR重組反應(yīng)所需的L4和L3序列、光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體基質(zhì)定位序列(T*)及報(bào)告基因GFP的Gateway入門載體，本發(fā)明還涉及該入門載體的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中使用的經(jīng)典雙元載體雖然也有不少含有葉綠體轉(zhuǎn)移肽序列，但是由于這類載體的分子量都很大(大于10kb)，因此通過經(jīng)典的限制性酶切/連接方法把目標(biāo)基因亞克隆到這些雙元載體上的分子操作難度都相當(dāng)大。此外還可能遇到的一些情況是雙元載體上有限的多克隆酶切位點(diǎn)在某些目的基因中都有，因此不能直接用酶切和連接的方法構(gòu)建表達(dá)載體，這樣就需要用平末端連接策略，這些過程又會(huì)加大載體構(gòu)建的難度和步驟，因此有時(shí)即使花了很多時(shí)間和經(jīng)費(fèi)也無法成功構(gòu)建出目的基因的植物表達(dá)載體。

Invitrogen公司根據(jù)λ噬菌體基因組和大腸桿菌基因組之間的位點(diǎn)專一性重組分子機(jī)制開發(fā)了一套分子克隆新技術(shù)，即通路克隆(Gateway)技術(shù)，Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)體系是根據(jù)λ噬菌體基因組從大腸桿菌的基因組中切離的機(jī)制設(shè)計(jì)出來的，利用Gateway的LR反應(yīng)可以構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體。利用限制性內(nèi)切酶和連接酶構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)需要對DNA進(jìn)行切割并回收目標(biāo)片斷，然后用連接酶連接，這是一種費(fèi)時(shí)間又費(fèi)錢的工作。用Gateway技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)不需要利用限制性內(nèi)切酶和連接酶，它只需要把兩種質(zhì)粒DNA混合并加入DNA整合或切離所需要的蛋白質(zhì)就能完成新質(zhì)粒的構(gòu)建，因此可以節(jié)省很多時(shí)間。葉片是植物的光合作用器官，在葉綠體中有很多的代謝途徑，如果要對這些途徑進(jìn)行改造，就需要使目的蛋白表達(dá)后定位到葉綠體中，但是目前Invitrogen公司開發(fā)的Gateway技術(shù)體系中沒有植物表達(dá)載體，而比利時(shí)的VIB/Gent公司開發(fā)的所有Gateway植物表達(dá)載體都沒有葉綠體的轉(zhuǎn)移肽序列，因此利用這些表達(dá)載體表達(dá)的目的蛋白只能定位在細(xì)胞質(zhì)中，這就極大地限制了Gateway技術(shù)在植物基因工程操作中的應(yīng)用。葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是最近發(fā)展起來的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使用這種技術(shù)可以通過葉綠體的蛋白質(zhì)表達(dá)體系使目的蛋白直接在葉綠體中合成，但是這種技術(shù)只在少數(shù)幾種植物中獲得成功，目前還不能普遍使用。1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表達(dá)量最大的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)的含量占植物細(xì)胞中可溶性蛋白的40-50％。Rubisco的小亞基(rbcS)由細(xì)胞核基因編碼，控制rbcS基因表達(dá)的啟動(dòng)子為光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)，在PrbcS的下游有將rbcS定位到葉綠體基質(zhì)的信號肽序列(T)，PrbcS的表達(dá)有很強(qiáng)的組織特異性，需要光信號的誘導(dǎo)，在葉片中的表達(dá)最強(qiáng)(Sugita?et?al.，1987，MGG，209：247-256)。在科研工作中PrbcS常被用來實(shí)現(xiàn)目的基因在葉片中的高水平表達(dá)和目的蛋白在葉綠體中的定位(Jang?et?al.，1999?Mol?Breed?5：453-461；Wong?et?al.，Plant?Mol?Biol?20：80-93)。