[發(fā)明專利]通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*及其構建方法和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010110946.5
• 申請日: 2010-02-21
• 公開（公告）號: CN101831454A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設計）人: 陳麗梅;肖素勤;王莎莎;梁峰;李莉;孫振;嚴金平;李昆志
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/82
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco小亞基基因的光誘導型啟動子PrbcS和葉綠體基質定位序列T*及綠色熒光蛋白GFP報告基因。

2.通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，采用Gateway的入門載體pEN-L4-2-L3為基本骨架構建，用一對互補引物HindIII5和HindIII3，通過點突變技術在pEN-L4-2-L3的attL4位點下游引入HindIII位點產生入門載體pEN-L4*-2-L3；再利用另一對互補引物XhoI5和XhoI3，通過點突變技術把pEN-L4*-2-L3中attL3位點下游的多克隆位點中的PstI位點改為XhoI產生入門載體pEN-L4*-2-L3*；最后用HindIII和XhoI切開pEN-L4*-2-L3*和pENTR*-PrbcS-*T-GFP，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后產生的載體片斷pEN-L4*-L3*及pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割產生的PrbcS-*T-GFP?DNA片段，用連接酶把pEN-L4*-L3*和PrbcS-*T-GFP連接起來產生入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。

3.通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，由下述方法構建而成：

(1)利用一對互補引物HindIII5和HindIII3，通過點突變技術在入門載體pEN-L4-2-L3的attL4重組位點下游處引入HindIII產生入門載體pEN-L4*-2-L3；

(2)利用一對互補引物XhoI5和XhoI3，通過點突變技術把入門載體pEN-L4*-2-L3中attL3重組位點下游多克隆位點中的PstI位點改為XhoI產生入門

載體pEN-L4*-2-L3*；

(3)用HindIII和XhoI切開pEN-L4*-2-L3*和pENTR*-PrbcS-*T-GFP，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后產生的載體片斷pEN-L4*-L3*及pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割產生的PrbcS-*T-GFP?DNA片段，用連接酶把pEN-L4*-L3*和PrbcS-*T-GFP連接起來產生入門載pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。

4.如權利1-3的通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，其中光誘導型啟動子PrbcS是從番茄的基因組中分離出來的rbcS-3C的啟動子，是一個由HindIII切割產生的1.7kb的DNA片斷。

5.如權利1-3的通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，其中報告基因GFP來自Invitrogen公司的pGFP中的GFP。

6.權利要求1-3的通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的構建方法，包括下述步驟：

(1)利用一對互補引物HindIII5和HindIII3，通過點突變技術在入門載體pEN-L4-2-L3的attL4重組位點下游處引入HindIII產生入門載體pEN-L4*-2-L3；

(2)利用一對互補引物XhoI5和XhoI3，通過點突變技術把入門載體pEN-L4*-2-L3中attL3重組位點下游多克隆位點中的PstI位點改為XhoI產生入門載體pEN-L4*-2-L3*；

(3)用HindIII和XhoI切開pEN-L4*-2-L3*和pENTR*-PrbcS-*T-GFP，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后產生的載體片斷pEN-L4*-L3*及pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割產生PrbcS-*T-GFP?DNA片段，用連接酶把pEN-L4*-L3*和PrbcS-*T-GFP連接起來獲得入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。

7.權利要求1-3的通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*在制備串聯兩個目的基因表達盒的植物表達載體中的應用。

8.權利要求1-3的通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*在實現目的基因在轉基因植物葉片中的表達的遺傳工程中的應用。