[發明專利]小鼠巨細胞病毒實時熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201010110266.3
• 申請日: 2010-02-03
• 公開（公告）號: CN101935712A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 陳林鳳;潘振華;張紅;盛青松
• 申請（專利權）人: 無錫奧瑞生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 曹祖良

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種病毒檢測方法，具體的地說是一種小鼠巨細胞病毒實時熒光定量PCR檢測方法。?

背景技術

小鼠巨細胞病毒(Murine?Cytomegalovirus，MCMV)屬皰疹病毒科，是一種可引起持續性感染的病毒。機體抵抗力低時可引起急性發病死亡，導致實驗失敗。?

目前，檢測各種病毒的方法很多，如血清學試驗、組織塊培養和共培技術、核酸雜交和常規PCR檢測技術等，其中常規PCR檢測技術敏感性、特異性、穩定性和可操作性都比較好，但常規PCR反應后的處理存在交叉污染，也比較容易出現假陽性結果，并且實驗時間也相對較長。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述不足，提供一種小鼠巨細胞病毒實時熒光定量PCR檢測方法，該檢測方法的檢測靈敏度可達到1.0×10⁴個拷貝的病毒分子，對于單個樣本檢測時間為2個小時，可同時進行大批量的樣本分析，具有良好的特異性、敏感性、重復性和穩定性，適用于病毒感染的前期診斷。?

實時熒光定量PCR檢測技術就填補了現有技術的缺陷，無論是在研究中還是在臨床樣品的檢測上，實時熒光定量PCR快速、敏感的特性使它成為應用于檢測微生物的有效方法。實時熒光定量PCR技術具有以下優點：(1)PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性；(2)儀器自動分析，效率高、無后續處理；(3)獨特的定量原理，即時反映擴增過程，摒棄終點數據，更適用于定量，結果重現性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系統，所有試劑均是一次擴增，毋須開蓋，不產生污染。?

按照本發明提供的技術方案，所述小鼠巨細胞病毒實時熒光定量PCR方法包括步驟如下：?

1、標準質粒的構建：在美國國立生物信息中心NCBI基因庫(Genbank)中檢索獲得小鼠巨細胞病毒的保守基因，利用基因克隆技術構建含有該保守基因序列的標準質粒分子；?

2、特異性引物及熒光探針的設計：以步驟1中選取的高度保守序列為基準，設計一對特異性引物及一條熒光探針；設計原則為：每條引物的長度為18～25個堿基，熒光探針長度為20～30個堿基；特異性引物和熒光探針中GC含量要求在40～60％，理論Tm＞50℃；特異性引物和熒光探針自身以及特異性引物和熒光探針之間的3’端避免堿基配對；選用的特異性引物和熒光探針要設計在小鼠巨細胞病毒基因中的保守區，只對小鼠巨細胞病毒特異，和其他物種無交叉反應；熒光探針應位于一對特異性引物之間的區域；?

所述特異性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中?

正向引物的序列為：5’-AGCGTCGATGCAGGGGCTTT-3’，?

反向引物的序列為：5’-CGGCGGAACGGGGGCTGGTA-3’；?

所述熒光探針的序列為：5’-CGGGGGCGTTCCGAAAACGA-3’；?

3、實時熒光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線，包括步驟：?

(1)模板的制備：?

將步驟1中構建的標準質粒作10倍系列稀釋，以稀釋液為模板；具體如下：定量標準質粒為3.01×10⁹拷貝/μl，用稀釋液將標準質粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀釋液，稀釋液在-20℃條件下保存備用；?

(2)實時熒光定量PCR反應體系：?

25μl的PCR反應體系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；?

(3)循環反應：?

根據步驟(2)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入熒光PCR儀中，設置相應的熒光采集條件后進行擴增，反應循環程序為：(a)、95℃預變性5min，1個循環；(b)、95℃變性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40個循環后反應結束，得到反應產物；?

(4)建立檢測標準曲線：熒光PCR儀采集熒光信號，經計算機軟件自動生成以起始模板數對數為x軸，C_T值為y軸的標準曲線；?