[發明專利]仙臺病毒實時熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201010110255.5
• 申請日: 2010-02-03
• 公開（公告）號: CN101928784A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 潘振華;陳林鳳;張紅;盛青松
• 申請（專利權）人: 無錫奧瑞生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 曹祖良

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種病毒檢測方法，具體的地說是一種仙臺病毒實時熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

仙臺病毒(Sendai?virus)屬RNA病毒中的副黏液病毒科第一型，可在小鼠、大鼠、豚鼠等多種嚙齒類實驗室動物中導致自然感染甚至死亡，小鼠仙臺病毒很難控制，常呈隱性感染，急性型多見于20日齡左右乳鼠，表現呼吸道癥狀。仙臺病毒感染可對實驗研究產生嚴重干擾，如改變體液和細胞介導的免疫應答，可改變被感染的腫瘤細胞的表面抗原及其致癌性。

目前，檢測各種病毒的方法很多，如血清學試驗、組織塊培養和共培技術、核酸雜交和常規PCR檢測技術等，其中常規PCR檢測技術敏感性、特異性、穩定性和可操作性都比較好，但常規PCR反應后的處理存在交叉污染，也比較容易出現假陽性結果，并且實驗時間也相對較長。而實時熒光定量PCR檢測技術就填補了以上的缺陷，無論是在研究中還是在臨床樣品的檢測上，實時熒光定量PCR快速、敏感的特性使它成為應用于檢測微生物的有效方法。實時熒光定量PCR技術具有以下優點：(1)PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性；(2)儀器自動分析，效率高、無后續處理；(3)獨特的定量原理，即時反映擴增過程，摒棄終點數據，更適用于定量，結果重現性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系統，所有試劑均是一次擴增，毋須開蓋，不產生污染。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述不足，提供一種仙臺病毒實時熒光定量PCR檢測方法，該檢測方法的檢測靈敏度可達到1.0×10⁴個拷貝的病毒分子，對于單個樣本檢測時間為2個小時，可同時進行大批量的樣本分析，具有良好的特異性、敏感性、重復性和穩定性，適用于病毒感染的前期診斷。

按照本發明提供的技術方案，所述仙臺病毒實時熒光定量PCR方法包括步驟如下：

1、標準質粒的構建：在美國國立生物信息中心NCBI基因庫(Genbank)中檢索獲得仙臺病毒的保守基因，利用基因克隆技術構建含有該保守基因序列的標準質粒分子；

2、特異性引物及熒光探針的設計：以步驟1中選取的高度保守序列為基準，設計一對特異性引物及一條熒光探針；設計原則為：每條引物的長度為18-25個堿基，熒光探針長度為20～30個堿基；特異性引物和熒光探針中GC含量要求在40-60％，理論Tm＞50℃；特異性引物和熒光探針自身以及特異性引物和熒光探針之間的3’端避免堿基配對；選用的特異性引物和熒光探針要設計在仙臺病毒基因中的保守區，只對仙臺病毒特異，和其他物種無交叉反應；熒光探針應位于一對特異性引物之間的區域；

所述特異性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中

正向引物的序列為：5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’，

反向引物的序列為：5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’；

所述熒光探針的序列為：5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’；

3、實時熒光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線，包括步驟：

(1)模板的制備：

將步驟1中構建的標準質粒作10倍系列稀釋，以稀釋液為模板；具體如下：定量標準質粒為2.98×10⁹拷貝/μl，用稀釋液將標準質粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀釋液，稀釋液在-20℃條件下保存備用；

(2)實時熒光定量PCR反應體系：

25μl的PCR反應體系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循環反應：

根據步驟(2)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入熒光PCR儀中，設置相應的熒光采集條件后進行擴增，反應循環程序為：(a)、95℃預變性5min，1個循環；(b)、95℃變性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40個循環后反應結束，得到反應產物；