[發(fā)明專(zhuān)利]仙臺(tái)病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010110255.5
• 申請(qǐng)日: 2010-02-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101928784A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘振華;陳林鳳;張紅;盛青松
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 無(wú)錫奧瑞生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 曹祖良

1.仙臺(tái)病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建、特異性引物及熒光探針的設(shè)計(jì)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的制備、有效性驗(yàn)證及結(jié)果檢測(cè)判定，其特征在于，所述特異性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中

正向引物的序列為：5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’，

反向引物的序列為：5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’；

所述熒光探針的序列為：5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’。

2.如權(quán)利要求1所述的仙臺(tái)病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征還在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟為：

(1)將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作10倍系列稀釋?zhuān)韵♂屢簽槟０澹痪唧w如下：定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為2.98×10⁹拷貝/μl，用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍稀釋?zhuān)聪♂尦蓾舛确謩e為1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀釋液，稀釋液在-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：

25μl的PCR反應(yīng)體系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循環(huán)反應(yīng)：

根據(jù)步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入熒光PCR儀中，設(shè)置相應(yīng)的熒光采集條件后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)椋?a)、95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；(b)、95℃變性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40個(gè)循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)產(chǎn)物；

(4)建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線：熒光PCR儀采集熒光信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)生成以起始模板數(shù)對(duì)數(shù)為x軸，C_T值為y軸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.如權(quán)利要求1所述的仙臺(tái)病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征還在于，所述有效性驗(yàn)證及結(jié)果檢測(cè)判定的步驟為：

(1)利用未感染仙臺(tái)病毒小鼠的cDNA配制陰性對(duì)照PCR反應(yīng)體系：25μl的陰性對(duì)照PCR反應(yīng)體系為含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染仙臺(tái)病毒小鼠的cDNA，1μl；

利用感染仙臺(tái)病毒小鼠的cDNA制備陽(yáng)性對(duì)照PCR反應(yīng)體系：25μl的陽(yáng)性對(duì)照PCR反應(yīng)體系為含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Tag?DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染仙臺(tái)病毒小鼠的cDNA，1μl；

(2)循環(huán)反應(yīng)：

按照步驟(1)中的PCR反應(yīng)體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入熒光PCR儀中，設(shè)置相應(yīng)的熒光采集條件后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)椋?a)、95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；(b)、95℃變性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40個(gè)循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)產(chǎn)物；

(3)有效性驗(yàn)證：

熒光PCR儀采集熒光信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件生成陰性對(duì)照點(diǎn)和陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)；陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)C_T值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)準(zhǔn)曲線上，并且其C_T值應(yīng)＜30，否則重做。